猶如大力水手愛吃菠菜，這款CAR－T要“吃”四環(huán)素才工作——

CAR－T是一種出現(xiàn)了很多年，但近幾年才得以臨床應(yīng)用的新型細(xì)胞療法。日前，《分子科學(xué)》登載了我國(guó)科學(xué)家對(duì)于CAR－T安全性的研究工作：上海海洋大學(xué)國(guó)際海洋生物科學(xué)研究中心、比昂生物等多個(gè)單位合作，運(yùn)用我國(guó)擁有自主專利的慢病毒載體技術(shù)，將“四環(huán)素調(diào)控”的基因開關(guān)整合到時(shí)下最廣泛使用的白血病治療手段CAR－T中，實(shí)現(xiàn)了對(duì)CAR－T細(xì)胞的控制，只有當(dāng)CAR－T感受到四環(huán)素這一特定化合物的存在時(shí)，才會(huì)啟動(dòng)“格斗”模式，勤懇殺敵，而一旦有指標(biāo)表明T細(xì)胞有“殺紅眼”的跡象，只需停止四環(huán)素的供應(yīng)，CAR－T格斗士就會(huì)缺乏能量宕機(jī)，防止對(duì)機(jī)體的“自殺式”損傷。

T細(xì)胞“火力全開”，伴隨可怕“風(fēng)暴”

免疫療法的出現(xiàn)，使得人體內(nèi)免疫系統(tǒng)被“爭(zhēng)取”過來，通過對(duì)T細(xì)胞加裝體外基因元器件或重啟免疫殺伐功能，形成對(duì)抗腫瘤的“生力軍”。目前，治療白血病有效率最高的方法為CAR－T療法，是通過將T細(xì)胞導(dǎo)出，在體外裝上有“導(dǎo)航”“偵測(cè)”作用的CAR（嵌合抗原受體），再回輸體內(nèi)對(duì)付癌細(xì)胞，但T細(xì)胞的進(jìn)攻“火力”會(huì)由于人工的干預(yù)，而不受體內(nèi)調(diào)控機(jī)制的控制，“失控”的情況下很可能造成嚴(yán)重的細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）。

“CRS被業(yè)界形象地稱為‘細(xì)胞因子風(fēng)暴’�！闭撐耐ㄓ嵶髡�、上海海洋大學(xué)特聘教授楊光華解釋，細(xì)胞因子風(fēng)暴是由T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的相互作用引起的。由于“重裝戰(zhàn)士”T細(xì)胞有導(dǎo)航和偵測(cè)系統(tǒng)，它能夠敏銳地感受到腫瘤細(xì)胞的存在，細(xì)胞內(nèi)通路進(jìn)而被激發(fā)，釋放大量的細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子正是免疫細(xì)胞殺伐腫瘤細(xì)胞、能夠使其凋亡的“重要火力”。

“細(xì)胞因子引發(fā)的風(fēng)暴是CAR－T治療中不可回避的�！睏罟馊A說，它不但是治療中的副作用，也是治療腫瘤的臨床表現(xiàn)。

美國(guó)女孩艾米麗（Emily）是首位CAR－T治愈的白血病患兒，她有著可怕的“風(fēng)暴”經(jīng)歷。據(jù)記載，在細(xì)胞注射到體內(nèi)后，艾米麗迅速發(fā)燒，血壓驟降，重度昏迷，在重癥監(jiān)護(hù)室里靠呼吸機(jī)熬過了兩周。當(dāng)時(shí)醫(yī)生們已經(jīng)覺得她不可能活下來了。檢測(cè)報(bào)告顯示，她體內(nèi)的IL－6蛋白激增，這表明她的免疫系統(tǒng)正在不斷攻擊自身。隨后，醫(yī)生決定給她使用一種免疫抑制藥物阻止這種自身攻擊。用藥后幾小時(shí)內(nèi)，艾米麗的情況立即變好，進(jìn)一步檢測(cè)結(jié)果顯示，她體內(nèi)的癌細(xì)胞消失了。

可見，CAR－T誘發(fā)“風(fēng)暴”不可避免。但由于CAR－T擁有80％—90％的高治愈率，使得盡管這種療法相當(dāng)危險(xiǎn)，去年仍被美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)可用于臨床，并于今年4月被批準(zhǔn)進(jìn)入美國(guó)醫(yī)保。

如何讓擁有高治愈率的CAR－T告別高風(fēng)險(xiǎn)？學(xué)界進(jìn)行了大量的研究，并提出多種技術(shù)路線，例如施用免疫抑制藥物、植入誘導(dǎo)型自殺基因系統(tǒng)、嚴(yán)重情況需采用激素處理等，但目前“風(fēng)暴”并發(fā)癥仍是其成為標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)療護(hù)理的障礙。業(yè)內(nèi)普遍認(rèn)為，CAR－T應(yīng)用的難點(diǎn)并不集中在前期的細(xì)胞治療，而在于后期的副作用處理及質(zhì)量控制。

“抑制劑的‘補(bǔ)救’很難掌握主動(dòng)權(quán)�！睏罟馊A表示，通過基因元件的“供能”控制將更具有主動(dòng)權(quán)，也有更多地可操作性。

變病毒為友軍，給T細(xì)胞加個(gè)“遙控器”

“CAR－T技術(shù)專利幾乎被美國(guó)涵蓋�！睏罟馊A說。實(shí)際上，美國(guó)醫(yī)療領(lǐng)域仍在不斷探索新機(jī)制，例如今年4月《自然》報(bào)道，紀(jì)念斯�。瓌P特琳癌癥中心（MSK）發(fā)現(xiàn)預(yù)防“風(fēng)暴”的新細(xì)胞理論以及新抑制劑并已經(jīng)申請(qǐng)專利。

“我們不能跟著別人的思路對(duì)‘風(fēng)暴’進(jìn)行控制，那到應(yīng)用時(shí)會(huì)遇到‘專利門檻’�！睏罟馊A說，為此，他帶領(lǐng)團(tuán)隊(duì)從2009年開始從另一個(gè)角度入手，試圖給T細(xì)胞加個(gè)“遙控器”，增加CAR－T技術(shù)中人們對(duì)T細(xì)胞的控制力。

“慢病毒載體是人們進(jìn)行基因工程操作的一個(gè)有效工具�！睏罟馊A說，慢病毒載體和病毒一樣能夠“侵入”細(xì)胞，但并不具有毒性，能把目標(biāo)片段插入目標(biāo)細(xì)胞中，從而實(shí)現(xiàn)基因的改造。

要把病毒“馴化”成友軍并不容易，臨床要求嚴(yán)格，并且大規(guī)模生產(chǎn)和純化非常困難。楊光華團(tuán)隊(duì)試圖通過慢病毒載體對(duì)CAR－T進(jìn)行改良，并使其實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，同時(shí)依托該技術(shù)成立了上海比昂生物醫(yī)藥科技有限公司�！安煌�于常見的化學(xué)合成藥物，基因藥物的大規(guī)模生產(chǎn)與純化非常困難。目前在基因載體大規(guī)模生產(chǎn)上，比昂生物的純化率已經(jīng)比國(guó)際同行的高10倍。”楊光華說，慢病毒載體的生產(chǎn)包含了質(zhì)粒獲取、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、病毒收集與純化等一系列復(fù)雜的步驟，每一個(gè)步驟都會(huì)影響最后獲得的載體活性，因此需要在工藝上不斷優(yōu)化，才能得到高質(zhì)量的載體。

在轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，團(tuán)隊(duì)對(duì)載體用量、轉(zhuǎn)導(dǎo)條件、T細(xì)胞培養(yǎng)、增強(qiáng)劑的使用等關(guān)鍵條件進(jìn)行了探索與優(yōu)化，最后取得成功�！八�有的技術(shù)都已申請(qǐng)了專利。核心發(fā)明專利已經(jīng)由國(guó)際專利體系PCT授權(quán)�！睏罟馊A說，“我們同時(shí)具有病毒類載體大規(guī)模生產(chǎn)工藝專利技術(shù)，可滿足國(guó)內(nèi)外制藥公司、醫(yī)院等對(duì)CAR－T可誘導(dǎo)慢病毒的需要，用于Ⅰ期和Ⅱ期的臨床實(shí)驗(yàn)�！�

體外實(shí)驗(yàn)證明，“四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)”高效

“開關(guān)系統(tǒng)通過基因合成、酶切連接等分子生物學(xué)技術(shù)，我們將‘四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)’與CD19－CAR結(jié)構(gòu)一起整合進(jìn)慢病毒載體中�！睏罟馊A說，這樣在對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行CAR改造的同時(shí)，“四環(huán)素遙控器”也就同步裝配了。

服用四環(huán)素后，進(jìn)入人體的CAR－T就開始發(fā)揮作用；停止服藥后，CAR－T將不再表達(dá)，而且能通過藥物劑量來控制CAR－T療效的強(qiáng)弱。這樣帶來的好處是當(dāng)患者出現(xiàn)難以承受的不良反應(yīng)時(shí)，停止服用四環(huán)素就可以讓患者體內(nèi)發(fā)揮作用的CAR－T停下來，當(dāng)患者耐受性逐漸轉(zhuǎn)好之后，又可以通過服藥繼續(xù)開始治療。在間隔期間，B細(xì)胞可以恢復(fù)，增強(qiáng)抗癌效果。

“臨床前的基本研究，取得了效果非常好的數(shù)據(jù)。”楊光華說，在此次研究中，他們通過將“四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)”結(jié)合到CD19－CAR構(gòu)建物中，開發(fā)出新的誘導(dǎo)性細(xì)胞iCAR19 T。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，新的iCAR19 T細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子產(chǎn)生、CAR表達(dá)、CD19特異性細(xì)胞毒性強(qiáng)。用四環(huán)素衍生物誘導(dǎo)48小時(shí)后，誘導(dǎo)細(xì)胞的相對(duì)CAR表達(dá)量是未誘導(dǎo)細(xì)胞的5倍，說明四環(huán)素的施用能激發(fā)“四環(huán)素戰(zhàn)士”的戰(zhàn)斗力。此外，經(jīng)四環(huán)素衍生物處理的細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞有非常顯著的高特異性裂解。這些結(jié)果表明植入系統(tǒng)成功地控制了iCAR19 T細(xì)胞的活性。“我們對(duì)T細(xì)胞的控制力越強(qiáng)，臨床安全性將越強(qiáng)。”楊光華說，新的細(xì)胞同時(shí)保持了強(qiáng)大的抗腫瘤作用。

“這項(xiàng)技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用于人體之前還需要經(jīng)過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、臨床試驗(yàn)等多個(gè)步驟驗(yàn)證其安全性和有效性。我們正在針對(duì)實(shí)際使用過程中可能遇到的問題，對(duì)這一技術(shù)做進(jìn)一步優(yōu)化調(diào)整，以盡快開展體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證�！睏罟馊A說，團(tuán)隊(duì)的目標(biāo)是臨床應(yīng)用，因此在實(shí)驗(yàn)階段就遵循GMP生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，所有的制造工藝和隨后的檢測(cè)都在GMP設(shè)施中進(jìn)行，基因載體的質(zhì)量控制也嚴(yán)格遵循FDA的指導(dǎo)原則。