與傳統(tǒng)的單光子寬視野熒光顯微鏡相比，多光子顯微鏡（MPM）具有光學(xué)切片和深層成像等功能，這兩個(gè)優(yōu)勢極大地促進(jìn)了研究者們對于完整活體大腦深處神經(jīng)的了解與認(rèn)識。2019年，Jerome Lecoq等人從大腦深處的神經(jīng)元成像、大量神經(jīng)元成像、高速神經(jīng)元成像這三個(gè)方面論述了相關(guān)的MPM技術(shù)［1］。

想要將神經(jīng)元活動與復(fù)雜行為聯(lián)系起來，通常需要對大腦皮質(zhì)深層的神經(jīng)元進(jìn)行成像，這就要求MPM具有深層成像的能力。激發(fā)和發(fā)射光會被生物組織高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素，雖然可以通過增加激光強(qiáng)度來解決散射問題，但這會帶來其他問題，例如燒壞樣品、離焦和近表面熒光激發(fā)。增加MPM成像深度最好的方法是用更長的波長作為激發(fā)光。

另外，對于雙光子（2P）成像而言，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個(gè)最大的深度限制因素，而對于三光子（3P）成像這兩個(gè)問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團(tuán)的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數(shù)量級的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強(qiáng)度的熒光信號。功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡的要求更高，它需要更快速的掃描，以便及時(shí)采樣神經(jīng)元活動；需要更高的脈沖能量，以便在每個(gè)像素停留時(shí)間內(nèi)收集足夠的信號。

復(fù)雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)既具有局部的連接又具有遠(yuǎn)程的連接。要想將神經(jīng)元活動與行為聯(lián)系起來，需要同時(shí)監(jiān)控非常龐大且分布廣泛的神經(jīng)元的活動，大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激，要想了解這種快速的神經(jīng)元動力學(xué)，就需要MPM具備對神經(jīng)元進(jìn)行快速成像的能力�？焖費(fèi)PM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù)。

單束掃描技術(shù)可以高速遍歷大視場（FOV）的神經(jīng)組織

使用MPM對神經(jīng)元進(jìn)行成像時(shí)，通過隨機(jī)訪問掃描—即激光束在整個(gè)視場上的任意選定點(diǎn)上進(jìn)行快速掃描—可以只掃描感興趣的神經(jīng)元，這樣不僅避免掃描到任何未標(biāo)記的神經(jīng)纖維，還可以優(yōu)化激光束的掃描時(shí)間。隨機(jī)訪問掃描（圖1）可以通過聲光偏轉(zhuǎn)器（AOD）來實(shí)現(xiàn)，其原理是將具有一個(gè)射頻信號的壓電傳感器粘在合適的晶體上，所產(chǎn)生的聲波引起周期性的折射率光柵，激光束通過光柵時(shí)發(fā)生衍射。通過射頻電信號調(diào)控聲波的強(qiáng)度和頻率從而可以改變衍射光的強(qiáng)度和方向，這樣使用1個(gè)AOD就可以實(shí)現(xiàn)一維橫向的任意點(diǎn)掃描，利用1對AOD，結(jié)合其他軸向掃描技術(shù)可實(shí)現(xiàn)3D的隨機(jī)訪問掃描。但是該技術(shù)對樣本的運(yùn)動很敏感，易出現(xiàn)運(yùn)動偽影。目前，快速光柵掃描即在FOV中進(jìn)行逐行掃描，由于利用算法可以輕松解決運(yùn)動偽影而被廣泛的使用。

圖1 基于AOD的體內(nèi)新皮層L2 ／ 3神經(jīng)元的雙光子成像［2］

快速光柵掃描有多種實(shí)現(xiàn)方式，使用振鏡進(jìn)行快速2D掃描，將振鏡和可調(diào)電動透鏡結(jié)合在一起進(jìn)行快速3D掃描，但可調(diào)電動透鏡由于機(jī)械慣性的限制在軸向無法快速進(jìn)行焦點(diǎn)切換，影響成像速度，現(xiàn)可使用空間光調(diào)制器（SLM）代替。

遠(yuǎn)程聚焦也是一種實(shí)現(xiàn)3D成像的手段，如圖2所示。在LSU模塊中，掃描振鏡進(jìn)行橫向掃描， ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M，通過調(diào)控M的位置實(shí)現(xiàn)軸向掃描。該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學(xué)像差，還可以進(jìn)行快速的軸向掃描。想要獲得更多神經(jīng)元成像，可以通過調(diào)整顯微鏡的物鏡設(shè)計(jì)來擴(kuò)大FOV，但是具有大NA和大FOV的物鏡通常重量較大，無法快速移動以進(jìn)行快速軸向掃描，因此大型FOV系統(tǒng)依賴于遠(yuǎn)程聚焦、SLM和可調(diào)電動透鏡。

圖2 遠(yuǎn)程聚焦雙光子成像系統(tǒng)的示意圖［3］多束掃描技術(shù)可以同時(shí)對神經(jīng)元組織的不同位置進(jìn)行成像

該技術(shù)如圖3所示。對兩個(gè)遠(yuǎn)距離（相距大于1－2 mm）的成像部位，通常使用兩條獨(dú)立的路徑進(jìn)行成像（圖3C，D）；對于相鄰區(qū)域，通常使用單個(gè)物鏡的多光束進(jìn)行成像（圖3E，F(xiàn)）。多光束掃描技術(shù)必須特別注意激發(fā)光束之間的串?dāng)_問題，這個(gè)問題可以通過事后光源分離方法或時(shí)空復(fù)用方法來解決。事后光源分離方法指的是用算法來分離光束消除串?dāng)_；時(shí)空復(fù)用方法指的是同時(shí)使用多個(gè)激發(fā)光束，每個(gè)光束的脈沖在時(shí)間上延遲，這樣就可以暫時(shí)分離被不同光束激發(fā)的單個(gè)熒光信號。引入越多路光束就可以對越多的神經(jīng)元進(jìn)行成像，但是多路光束會導(dǎo)致熒光衰減時(shí)間的重疊增加，從而限制了區(qū)分信號源的能力；并且多路復(fù)用對電子設(shè)備的工作速率有很高的要求；大量的光束也需要更高的激光功率來維持近似單光束的信噪比，這會容易導(dǎo)致組織損傷。

圖3 大面積成像技術(shù)

近年來，不同的MPM技術(shù)的發(fā)展拓寬了我們對神經(jīng)組織的成像范圍，使得我們可以以更快的速度對大腦深處更多的神經(jīng)元進(jìn)行成像，這大大推動了神經(jīng)科學(xué)的研究，使我們能夠?qū)δX功能有更清晰的理解。

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多光子顯微鏡成像技術(shù)之五：多光子顯微鏡用于診斷兒童特應(yīng)性皮炎

參考文獻(xiàn)

［1］ Lecoq J， Orlova N， Grewe BF． Wide． Fast． Deep： Recent Advances in Multiphoton Microscopy of In Vivo Neuronal Activity［J］． The Journal of Neuroscience． 2019， 39（46）： 9042–9052．

［2］ Grewe BF， Langer D， Kasper H， Kampa BM， Helmchen F． High－speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near－millisecond precision［J］． Nat Methods． 2010， 7：399－405．

［3］ Botcherby EJ， Smith CW， Kohl MM， De？barre D， Booth MJ， Juskaitis R， Paulsen O， Wilson T． Aberration－free three－dimensional multiphoton imaging of neuronal activity at kHz rates［J］． Proc Natl Acad Sci USA． 2012， 109： 2919－2924．