大家好,今天糖葫蘆跟大家分享一篇的6+分的學習筆記。

題目:乳腺癌或頭頸癌放射敏感性預測因子的分子分析

一、研究背景

近一半的癌癥是單獨或聯(lián)合放射治療,放療除了對癌癥的治療作用外,不可避免地涉及到正常組織的暴露,其中晚期和急性不良反應是治療的劑量限制因素。目前,還沒有可以可靠地預測個體對放射治療反應的檢測方法。這篇學習筆記從血漿蛋白和單核苷酸多態(tài)性兩個角度尋找放射敏感性預測因子和預測模型。

二、分析流程

三、結果解讀1、樣本的篩選

血液樣本來自先前放射治療(RT)的乳腺癌(BC)和頭頸癌患者(HNC),采集血樣的時間點為完成 RT 后 1 至 8 年,他們對放射的敏感性(使用ICPL區(qū)分,RR:耐輻射;RS:輻射敏感)均已知:BC 患者 29 例(12 例 RR 和 17 例 RS),HNC 患者 74例(37 例 RR 和 37 例 RS)。

基于先前的實驗研究、網(wǎng)絡分析工具以及其他文獻資料篩選出130個蛋白質(zhì),并且使用探索性親和蛋白組學挑選出259個抗體;通過文獻資料篩選出33個基因中的 55 個單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。

在 BC 研究集中,沒有發(fā)現(xiàn)不完整或離群樣本。在 HNC 研究集中,由于技術原因,排除了兩個樣本,并在主成分分析(PCA)圖中發(fā)現(xiàn)其中一個樣本存在一個具有不同蛋白質(zhì)組學特征的離群點。因此,最終確認了100 個用于本次研究的樣本:BC 患者 29 例(12 例 RR 和 17 例 RS),HNC 患者 71 例(35 例 RR 和 36 例 RS)�；颊邔�輻射的敏感性狀態(tài)沒有不平衡。

2、正常組織和癌組織對輻射的應答——研究蛋白

使用單因素分析篩選到8個在RR和RS患者之間存在顯著性差異的蛋白(Wilcoxon秩和分析p<0．05):STIM1, THPO, AKT1, IFNG, TPI1, DCXR, PNKD 和 FN1(圖1A、B)。

圖1．  Top候選者的蛋白質(zhì)譜 (A) STIM1 (B) THPO

使用logistic回歸篩選到額外的5個蛋白:SEPT7, ERCC1,IFNG , RAB5B 和 MBOAT7。同時,logistic回歸顯示對輻射敏感性和年齡、性別以及癌癥的類型均無關。

由于單變量分析不能控制所選候選預測器的冗余(也就是說,由于獨立的、信息豐富的目標蛋白數(shù)量有限,一組高相關的目標蛋白可能具有較小的預測能力),因此作者通過計算候選蛋白之間的關系系數(shù)(圖2A),并比較了其與所有候選蛋白質(zhì)之間的成對相關系數(shù)的分布(圖 2B)。大多數(shù)候選蛋白質(zhì)譜呈正相關。其中在STIM1 和 AKT1(r=0．73>0．7)、IFNG 和 PNKD(r=0．73>0．7)之間存在最高的正相關關系(圖3D), MBOAT7 和 IFNG(r=-0．35)存在最高的負相關關系(圖3B)。

圖2． 候選蛋白之間相關性

圖3． 候選蛋白之間相關性

使用 KEGG 通路對入圍蛋白進行功能注釋,結果顯示候選蛋白與癌癥信號、免疫反應、細胞增殖、代謝途徑和 DNA 修復這幾種生物學功能相關。

通過sandwich免疫分析驗證上述實驗中發(fā)現(xiàn)的最強的 RS 候選蛋白——THPO 和 STIM1。使用 THPO 的六種抗體和 STIM1 的五種抗體的組合。HNC 樣品的分析結果顯示:不同捕獲抗體對同一靶點的蛋白譜高度相關(圖 4A)。三種 STIM1 抗體 (HPA011018、HPA011088、HPA012123)和三種 THPO 抗體(HPA019596、HPA048828、HPA051629)顯示出顯著的一致性趨勢(圖 4B,C)。

圖4A．  STIM1和THPO抗體之間的相關性

圖4B、C．  使用sandwich免疫檢測來確定HNC樣本集中(B)STIM1和(C)THPO的趨勢

3、患者基因型及其與放射敏感性的關系

緊接著,對BC、HNC兩個樣本集中的33個基因的55個SNPs進行分析。有 5 個SNP 位于 VEGFA (血管內(nèi)皮生長因子)區(qū)域。通過 TRRUSTv2 數(shù)據(jù)庫搜索 VEGFA 轉錄因子(TFs),作者發(fā)現(xiàn)了另外6 個SNPs:HIF1A(缺氧誘導因子)中含有5個 SNP , TP53(17號染色體的基因,編碼一種抑癌蛋白)中含有1個 SNP。總的來說,3個基因(VEGFA、HIF1A、TP53)的11個SNP分析結果表明:僅在rs699947不同基因型的患者中VEGFA具有顯著不同的等位基因頻率(p=0．048)(圖5)。因此,在基因型水平上,使用SNPs預測輻射敏感性沒有統(tǒng)計學意義。

圖5． 不同基因型(AA-野生型、Aa-雜合子、AA-突變型)患者的VEGFA蛋白水平

4、 多蛋白模型預測放射敏感性

使用多重隨機驗證(MRV)方法,根據(jù)抗體與 RS 狀態(tài)的相關性和重要性評分對抗體進行排序。并使用“knee”方法來選擇最相關的抗體,從而選擇了 17 個抗體(圖6A)。與之對應的的蛋白分別是:AKT1、FN1、PNKD、STIM1、THPO、BLVRB、CHIT1、DBNL、FGA(對應2個抗體)、GCA、PDGFB、PGR、PPARA、RP2、SERPINC1 和 SLC4A1。

模型一:基于17個抗體;模型二:基于8個蛋白(CHIT1、PDGFB、PNKD、RP2、SERPINC1、SLC4A、STIM1、THPO 、PNKD和RP2);模型三:在模型二的基礎上增加了一個SNP(rs699947)。對這三個模型進行ROC曲線分析(圖6B),結果顯示模型一具有最好的診斷效能(區(qū)分RS和RR的能力),而模型二的診斷效能最差。

圖6A． 基于多重隨機驗證(MRV)的抗體排序  圖6B． 三個模型的ROC曲線比較

計算各模型RS 預測因子的OR值。結果顯示:對于絕大多數(shù)模型中涉及的蛋白質(zhì)譜,蛋白質(zhì)水平的增加預示著患者作為 RS 的幾率更高(表1)。同時,在模型 3 中觀察到顯著預測因子的比例最高,顯著預測因子包括CHIT1、PDGFB、PNKD、RP2、SERPINC1、SLC4A、STIM1 和 THPO 。

表1．  各模型RS 預測因子的OR值

使用邏輯回歸(LR)并根據(jù)閾值對各模型的分類性能做了總結。結果顯示:對于模型 1,觀察到 BC 和 HNC 患者的相似結果,而模型2和模型3 對 HNC 患者的 RS 狀態(tài)預測更準確。

表2．  各模型的邏輯回歸(LR)結果

小結

基于乳腺(n=29) 和頭頸部癌癥患者(n=74)樣本進行兩組研究:對 33 個基因中的 55 個單核苷酸多態(tài)性(SNPs)進行基因分型、通過基于親和力的血漿蛋白質(zhì)組學研究130 循環(huán)蛋白。在這兩個研究集中,發(fā)現(xiàn)了幾種具有預測能力的血漿蛋白,并通過sandwich免疫分析驗證了兩種最具預測能力的蛋白質(zhì)(THPO 和 STIM1)。通過將基因型和蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)整合到分析模型中,作者發(fā)現(xiàn) CHIT1、PDGFB、PNKD、RP2、SERPINC1、SLC4A、STIM1 和 THPO 以及 VEGFA 基因變異體 rs69947 預測了乳腺癌(AUC=0．76)和頭頸部癌(AUC=0．89)患者的放射敏感性。點擊下方的閱讀原文,即可獲取學習筆記原文。