前言

T細(xì)胞過(guò)繼療法目前已成為一種公認(rèn)的抗癌免疫療法,尤其在血液腫瘤表現(xiàn)出卓越的治療潛力。通過(guò)設(shè)計(jì)嵌合抗原受體(CAR)或αβ-T細(xì)胞受體(TCR)轉(zhuǎn)基因,編碼到載體(如慢病毒)中,用于T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。2017年,美國(guó)食品藥物監(jiān)督管理局(FDA)首次批準(zhǔn)了兩種CAR-T療法,即tisagenlecleucel(Kymriah?)和Axicabatagene ciloleucel(Yescarta?),分別用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病和彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤。到目前為止,已有5種CAR-T療法得到了批準(zhǔn)。

CAR-T/TCR-T細(xì)胞制造的關(guān)鍵步驟包括:采集患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)、用抗CD3/抗CD28抗體富集T細(xì)胞、病毒介導(dǎo)的體外轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴(kuò)增、冷凍保存和運(yùn)輸以及制劑和劑量的考慮。這五個(gè)屬性將包括在藥品開(kāi)發(fā)質(zhì)量指南Q8(R2)中提到的質(zhì)量目標(biāo)產(chǎn)品簡(jiǎn)介(QTPP)中,隨著臨床醫(yī)生對(duì)癌癥治療方案的日益了解,這五個(gè)屬性可能在I期和III期臨床試驗(yàn)之間發(fā)生變化。

隨著越來(lái)越多的CAR-T細(xì)胞療法的市場(chǎng)批準(zhǔn),可以對(duì)其制劑設(shè)計(jì)和給藥方式進(jìn)行比較。這些數(shù)據(jù)有助于指導(dǎo)未來(lái)更多自體T細(xì)胞藥物產(chǎn)品的生產(chǎn)和性能優(yōu)化。

T細(xì)胞劑量

向患者輸注后,CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)繼續(xù)增殖,并在一些患者體內(nèi)持續(xù)存在4年,與持續(xù)功能性的治療效果相關(guān)。市場(chǎng)上銷售的CAR-T細(xì)胞療法的藥代動(dòng)力學(xué)曲線通常顯示1-2周時(shí)的峰值水平(Tmax),總藥物暴露量(AUC0-28d)和最大峰值濃度(Cmax)。CAR-T細(xì)胞劑量?jī)?yōu)化的第一階段臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)仍然是一個(gè)有爭(zhēng)議的話題,但通常涉及3+3劑量遞增的變化,例如,在抗CD19 CAR-T細(xì)胞的I期研究中,10名復(fù)發(fā)/難治性B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤患者接受了2．5×107(n=3)、5×107(n=4)和1×108(n=3)CAR-T細(xì)胞的遞增劑量。下表顯示了五種FDA批準(zhǔn)的CAR-T細(xì)胞療法的劑量、主要容器和填充體積。

TCR-T細(xì)胞治療可能需要填充幾個(gè)袋子,因?yàn)閯┝?細(xì)胞數(shù)量)至少要大一個(gè)數(shù)量級(jí)。例如,在深圳第二人民醫(yī)院最近進(jìn)行的一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中,四名非小細(xì)胞肺癌患者接受NY-ESO-1的TCR-T細(xì)胞劑量范圍為1．67-10．60×109(中位數(shù)為7．16×109細(xì)胞,轉(zhuǎn)導(dǎo)效率36．6-96．6%),靜脈輸注1-3天。通過(guò)對(duì)上述劑量、填充量和主要容器的粗略比較,很明顯,制劑在滿足QTPP的制劑設(shè)計(jì)方面的選擇相對(duì)有限,即冷凍袋/小瓶中的冷凍保存,靜脈輸液T細(xì)胞濃度范圍為106–108 /mL。

生產(chǎn)自動(dòng)化

從癌癥患者獲得的PBMC的質(zhì)量和數(shù)量將受到疾病進(jìn)展、免疫功能和暴露于導(dǎo)致淋巴細(xì)胞減少的化療藥物的影響,它們的特性將反過(guò)來(lái)影響T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、增殖、表型(效應(yīng)/記憶、CD4+/CD8+比率等)以及最終可制造的劑量。因此,自體T細(xì)胞的常規(guī)制造仍然非常具有挑戰(zhàn)性。

上述的關(guān)鍵制造步驟需要復(fù)雜而漫長(zhǎng)的工作流程,以天到周為單位。簡(jiǎn)化T細(xì)胞制造過(guò)程是降低T細(xì)胞療法商品成本(COG)的重要策略。這推動(dòng)了制劑和填充-完成步驟朝著全自動(dòng)或半自動(dòng)方向的發(fā)展。

根據(jù)良好生產(chǎn)規(guī)范(GMP),在ISO14644-1 7級(jí)潔凈室(相當(dāng)于FDA 10000級(jí)和歐盟C級(jí))運(yùn)行的無(wú)菌產(chǎn)品的封閉端到端工作流程明顯優(yōu)于ISO 14644-1 5級(jí)潔凈室中需要密集手動(dòng)步驟的開(kāi)放流程(相當(dāng)于FDA 100級(jí),約等于歐盟A級(jí))。更先進(jìn)的培養(yǎng)設(shè)備實(shí)現(xiàn)了完全封閉、自動(dòng)化的端到端過(guò)程,這已在美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院臨床中心得到實(shí)現(xiàn),該中心為I/II期臨床試驗(yàn)提供TCR-T細(xì)胞。一份報(bào)告顯示擴(kuò)增10天后,獲得2．9(±0．7)×109個(gè)T細(xì)胞(含CAR轉(zhuǎn)基因慢病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為55%,存活率為96．5%,CD3+T細(xì)胞為98%)。

在擴(kuò)增并對(duì)原藥中的有核細(xì)胞(TNC)總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)之后,制劑步驟涉及細(xì)胞濃縮/洗滌和再懸浮/稀釋到含有二甲基亞砜(DMSO)的最終緩沖液中,使其達(dá)到藥品的目標(biāo)TNC濃度。在手動(dòng)過(guò)程中,目標(biāo)TNC/mL值可以通過(guò)必要的再懸浮/稀釋步驟很容易達(dá)到。而在一個(gè)封閉的自動(dòng)填充-完成過(guò)程中,需要通過(guò)原藥的TNC/mL值計(jì)算細(xì)胞濃度和稀釋步驟,以滿足藥物產(chǎn)品的目標(biāo)TNC/mL。去除掉用于質(zhì)控的藥品外,其余藥物按填充袋的參考有效填充體積分裝。通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率計(jì)算CAR/TCR陽(yáng)性T細(xì)胞的數(shù)量,該值應(yīng)符合治療劑量,并在藥品標(biāo)簽上列出。T細(xì)胞藥品需要滿足放行規(guī)格,如下表所列。

填充-完成

蠕動(dòng)泵在硅膠管的支撐段內(nèi)產(chǎn)生流動(dòng),該硅膠管是一次性使用裝置(SUS)的一部分,是維持封閉端到端T細(xì)胞過(guò)程的方便解決方案。所有管道、過(guò)濾器、接頭和袋子都經(jīng)過(guò)預(yù)消毒,封閉式灌裝-精加工工作流程可確保ISO 14644-1 7級(jí)(最低)潔凈室中的產(chǎn)品質(zhì)量。

蠕動(dòng)泵在硅管中產(chǎn)生精確、無(wú)脈動(dòng)的流動(dòng),可將大體積范圍的藥物產(chǎn)品裝入不同大小和數(shù)量的袋子中�？赡軐⒖諝鈴拇篌w積袋帶入藥品袋仍然是一個(gè)問(wèn)題,可以考慮監(jiān)測(cè)袋重。緩沖成分的混合效率需要注意,因?yàn)檩o料濃度必須保持在藥物開(kāi)發(fā)研究期間規(guī)定的配方設(shè)計(jì)空間內(nèi)。DMSO的濃度可以通過(guò)比較制劑步驟前后和解凍后的滲透壓和T細(xì)胞質(zhì)量/數(shù)量來(lái)確定。

主容器選擇

主容器是與藥品直接接觸的容器,對(duì)于目前上市的CAR-T產(chǎn)品,主容器是能夠承受低溫儲(chǔ)存的袋子或小瓶。目前的首選似乎是乙烯-醋酸乙烯酯(EVA)或聚烯烴袋,其中有多家制造商。這與聚氯乙烯(PVC)作為血液制品(如紅細(xì)胞)低溫袋材料的長(zhǎng)期使用不同,常用的PVC增塑劑是鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)。DEHP已被證明是有爭(zhēng)議的,因?yàn)樗鼤?huì)滲入血液制品中,盡管它的存在會(huì)穩(wěn)定紅細(xì)胞膜,但它是一種已知的致癌物和內(nèi)分泌干擾物,對(duì)人類和環(huán)境都有影響。長(zhǎng)期提取增塑劑也會(huì)降低PVC的柔韌性,因此,PVC不適合作為T細(xì)胞的主容器材料。

EVA可滲透氣態(tài)CO2和O2,這是在T細(xì)胞填充-完成步驟和給藥之間維持細(xì)胞代謝和活力所必需的。對(duì)于水蒸氣,滲透系數(shù)分別比CO2和O2大3到4個(gè)數(shù)量級(jí)。相比之下,PVC和PE對(duì)水蒸氣、CO2和O2的滲透性較低。

主容器必須足夠堅(jiān)固,能夠承受運(yùn)輸條件下的低溫,以及解凍至環(huán)境溫度。雖然文獻(xiàn)中不經(jīng)常報(bào)告,但袋故障確實(shí)會(huì)發(fā)生。Mele等人報(bào)告了377袋外周血祖細(xì)胞(PBPC)的破裂率為1．06%(4袋)。在四個(gè)袋子中,三個(gè)在從液氮罐中取出的過(guò)程中破裂,一個(gè)由于意外損壞。Khuu等人記錄了體積為25–75 mL PBPC或淋巴細(xì)胞藥物產(chǎn)品的EVA袋故障率, 2000-2002年三年的故障率分別為1．7%(10/599)、9．6%(58/605)和0%(0/177)。高故障率歸因于來(lái)自一個(gè)供應(yīng)商的特定袋批次,而不是產(chǎn)品類型、配方、儲(chǔ)存或冷凍所致。

顆粒物、可提取物和可浸出物

通過(guò)采用SUS進(jìn)行T細(xì)胞處理,消除了工藝轉(zhuǎn)換和清潔/蒸汽產(chǎn)生的潛在污染,但SUS材料必須具有更好的性能、純度,并且實(shí)際上不含微粒�？商崛∥锸侵冈跇O端條件下從SUS中釋放出來(lái)的化學(xué)物質(zhì),包括在藥品保質(zhì)期內(nèi)遷移出去的可浸出物。

顆粒物同樣受到監(jiān)管機(jī)構(gòu)的控制,因?yàn)槿绻�注�?它們有可能阻塞血管并損害組織/器官,具體取決于其大小、形狀、成分和數(shù)量。盡管SUS是在潔凈室中生產(chǎn)的,但不能排除在藥品填充過(guò)程中微粒粘附在塑料薄膜上并隨后被帶入主容器的可能性。美國(guó)材料與試驗(yàn)協(xié)會(huì)(American Society for Testing and Materials)提出了與用水或水加鹽沖洗SUS表面顆粒以生成定量分析懸浮液相關(guān)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化方法。

細(xì)胞藥物產(chǎn)品的凍融

冷凍速率是在給定DMSO濃度下控制冰核形成和生長(zhǎng)的方法。然而,。目前尚未就T細(xì)胞藥物產(chǎn)品的首選冷凍模式達(dá)成共識(shí),運(yùn)輸或儲(chǔ)存期間降低溫度漂移風(fēng)險(xiǎn)需要逐案評(píng)估。弗勞恩霍夫研究所(IBMT)開(kāi)發(fā)了一種新型機(jī)器人系統(tǒng),能夠在“IBMT培養(yǎng)基I”(10% DMSO和1% Poloxamer18)中精確地循環(huán)冷凍PBMC的溫度,濃度為107個(gè)細(xì)胞/ml。在-135°C和-60°C兩個(gè)溫度循環(huán)之間循環(huán)400次,保持了更高的PBMC活力和抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)。

T細(xì)胞產(chǎn)品完全解凍后應(yīng)立即輸注,無(wú)需進(jìn)一步稀釋。這就提出了如何最好地繼續(xù)解凍步驟的問(wèn)題,因?yàn)榇嬖诙鄠�(gè)選項(xiàng)。理論上,應(yīng)避免緩慢解凍,以防止去玻璃化,即加熱速率低于臨界升溫速率時(shí),無(wú)定形冰內(nèi)形成冰晶。此外,必須確保加熱的均勻性,以防止熱應(yīng)變導(dǎo)致物理應(yīng)力。

DMSO對(duì)細(xì)胞的物理效應(yīng)

DMSO是一種高效的細(xì)胞冷凍保護(hù)劑,但具有細(xì)胞毒性作用,因此需要從分子水平了解其對(duì)脂膜和細(xì)胞內(nèi)大分子的作用。DMSO分子與二棕櫚酰磷脂酰膽堿相互作用的分子動(dòng)力學(xué)模擬表明,DMSO插入脂質(zhì)頭基團(tuán)下方,破壞脂質(zhì)-脂質(zhì)排列,降低雙層剛性,促進(jìn)膜融合。因此,在冷凍和/或解凍過(guò)程中,細(xì)胞器和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)變形可以更容易適應(yīng),這是DMSO低溫保護(hù)作用的一個(gè)關(guān)鍵機(jī)制。

DMSO對(duì)T細(xì)胞制劑具有較高的滲透壓:即使是低濃度5%v/v的DMSO也相當(dāng)于704mOsmol/kg,這明顯高于血液。因此,T細(xì)胞制劑滲透壓的測(cè)量應(yīng)在藥品更廣泛的分析特性范圍內(nèi)。

新型賦形劑和T細(xì)胞制劑

DMSO具有潛在毒性,因此基于對(duì)DMSO使用的擔(dān)憂,人們?cè)诜e極地尋找替代性低溫保存劑。許多研究小組已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種賦形劑的組合,其中一些單獨(dú)用于上市藥物,特別是與T細(xì)胞冷凍保存相關(guān)的賦形劑組合。

用于細(xì)胞冷凍保存的商用無(wú)DMSO培養(yǎng)基的數(shù)量驚人地多,雖然大多數(shù)是無(wú)血清的,或化學(xué)級(jí)別的,但很少有“GMP級(jí)”,并且?guī)缀鯖](méi)有可以應(yīng)用于T細(xì)胞系的證據(jù)。一個(gè)例外是Stem CellBanker?,它用丙二醇(10%)代替DMSO,已經(jīng)用Jurkat細(xì)胞系進(jìn)行了測(cè)試,并具有公認(rèn)的FDA文件。然而,用丙二醇或甘油替代DMSO并不能緩解高滲壓或體內(nèi)毒性的擔(dān)憂。EMA發(fā)布了一份關(guān)于丙二醇作為靜脈給藥輔料的文件,包括兒童和成人的耐受性和建議限值。

小結(jié)

目前,全球多達(dá)上千項(xiàng)關(guān)于CAR-T或TCR-T細(xì)胞療法處于臨床開(kāi)發(fā)階段,CAR-T細(xì)胞的產(chǎn)品質(zhì)量也更多的受到人們的關(guān)注。從制劑的角度來(lái)看,未來(lái)需要解決的目標(biāo)包括更大范圍的細(xì)胞劑量和濃度、更優(yōu)的主容器和不同T細(xì)胞表型的共同制劑。為了支持這些目標(biāo),有必要推進(jìn)冷凍保存的研究,以便降低滲透壓、細(xì)胞毒性和非水溶劑暴露時(shí)間,同時(shí)提高對(duì)不同冷凍速率的耐受性。塑料性能的進(jìn)步將提高容器在超低溫下的堅(jiān)固性,新的焊接/密封工藝將提高SUS設(shè)計(jì)和組裝的靈活性。

FDA最近表示,“到2025年,我們預(yù)計(jì)FDA將每年批準(zhǔn)10到20種細(xì)胞和基因治療產(chǎn)品”,并將“最大限度地利用我們的加速項(xiàng)目,包括再生醫(yī)學(xué)高級(jí)治療(RMAT)的指定和加速批準(zhǔn)”。根據(jù)目前的批準(zhǔn),自體T細(xì)胞免疫療法將是這些細(xì)胞和基因治療產(chǎn)品的主要部分,并且制劑設(shè)計(jì)將在確保它們到達(dá)患者體內(nèi)方面起著關(guān)鍵作用。

參考文獻(xiàn):

1．Formulation Considerations for Autologous TCell Drug Products． Pharmaceutics． 2021 Aug; 13(8): 1317．