前言

尤文肉瘤(EWS)是一種骨或軟組織的惡性腫瘤,主要發(fā)生在兒童和年輕人中,是繼骨肉瘤之后第二常見(jiàn)的原發(fā)性骨腫瘤。傳統(tǒng)治療,包括積極的新輔助治療和輔助化療結(jié)合手術(shù)和/或放療,極大地提高了患者的長(zhǎng)期生存率,5年生存率超過(guò)70%。然而,一旦腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā),患者往往表現(xiàn)出較差的預(yù)后。

在過(guò)去十幾年中,新的免疫療法層出不窮,如免疫檢查點(diǎn)阻斷劑、治療性癌癥疫苗等。其中,CAR-T療法是一種變革性的治療方法,它通過(guò)基因工程在T細(xì)胞表達(dá)合成嵌合抗原受體(CAR),目前成為全球范圍癌癥治療的“常規(guī)” 手段。

最近,CAR-T療法也被用于實(shí)體瘤,其中也包括在原發(fā)性骨腫瘤中的應(yīng)用。CAR-T療法可能在這些EWS患者中發(fā)揮優(yōu)越的抗腫瘤作用。

CAR-T細(xì)胞

CARs由四個(gè)組成部分組成:細(xì)胞外抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域,最常見(jiàn)的是單鏈可變片段(scFv);結(jié)構(gòu)成分,如鉸鏈和跨膜結(jié)構(gòu)域;提供維持CAR-T細(xì)胞效應(yīng)器功能的共刺激信號(hào)結(jié)構(gòu)域,以及CD3ζ 激活域。

第一代CARs通常只包含CD3-ζ鏈信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。將一個(gè)共刺激分子添加到第一代CARs中產(chǎn)生了所謂的第二代CARs,而第三代CARs包括將兩個(gè)共刺激分子添加到第一代CARs中。這種方法不僅使免疫細(xì)胞具有靶向性,而且可以克服免疫耐受困境,使修飾后的免疫細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。

基于CAR-T細(xì)胞的療法顯示出強(qiáng)大的抗腫瘤活性,而不受傳統(tǒng)主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的限制。移植后,CAR-T細(xì)胞可以大量增殖,并表現(xiàn)出持久的抗腫瘤活性。

靶向EWS抗原的CAR-T細(xì)胞

CAR-T細(xì)胞在腫瘤治療中的有效應(yīng)用要求對(duì)腫瘤細(xì)胞具有特異性,因此,尋找腫瘤特異性抗原是一項(xiàng)非常重要的任務(wù)。目前,EWS中確定的靶點(diǎn)包括VEGFR2、IGF1R、ROR1、GD2、B7-H3(CD276)、EphA2和NKG2D配體。這些受體可作為CAR-T細(xì)胞治療EWS和抑制轉(zhuǎn)移的有效治療靶點(diǎn)。

VEGFR2

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是一種內(nèi)皮細(xì)胞特異性有絲分裂原,可誘導(dǎo)生理和病理性血管生成。VEGF受體(VEGFRs)包括VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3三種類型,其中VEGFR2在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞VEGF信號(hào)傳導(dǎo)中起主要作用。VEGF介導(dǎo)的信號(hào)通路已被證明存在于腫瘤細(xì)胞中,并且在腫瘤發(fā)生中起著關(guān)鍵作用。

在一項(xiàng)臨床前研究中,VEGFR2特異性CAR-T細(xì)胞能有效地裂解VEGFR2陽(yáng)性細(xì)胞,并產(chǎn)生有效的抗原特異性脫顆粒反應(yīng)、細(xì)胞因子分泌和增殖反應(yīng)。因此,VEGFR2可能是EWS中CAR-T細(xì)胞治療的合適靶點(diǎn)。VEGFR2靶向的CAR-T細(xì)胞已用于轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和上皮癌的早期臨床試驗(yàn)(NCT01218867),但目前的結(jié)果顯示臨床反應(yīng)較差。因此,進(jìn)一步研究VEGF信號(hào)通路對(duì)EWS治療的作用至關(guān)重要。

IGF1R

IGF1R是一種四聚體跨膜受體酪氨酸激酶。配體與IGF1Rα亞單位的結(jié)合導(dǎo)致β亞單位的自磷酸化和銜接蛋白的招募,最終導(dǎo)致信號(hào)級(jí)聯(lián)的激活,進(jìn)而促進(jìn)增殖、存活、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移和血管生成。由于IGF1R在EWS中表達(dá),許多實(shí)驗(yàn)將其用作EWS治療的免疫靶點(diǎn)。

一項(xiàng)體外研究表明,IGF1R靶向的CAR-T細(xì)胞表現(xiàn)出特異性細(xì)胞毒性,主要釋放針對(duì)肉瘤的IFN-γ、TNF-α和IL-13。此外,IGF1R靶向的CAR-T細(xì)胞也有利于局部肉瘤模型的延長(zhǎng)生存期。盡管IGF1R靶向的CAR-T細(xì)胞具有一定的抗腫瘤活性,但I(xiàn)GF1R也在正常組織中表達(dá),尚不清楚它們是否對(duì)身體有任何毒副作用。

在EWS的一項(xiàng)II期研究中,研究人員發(fā)現(xiàn)患者在使用ganitumab(一種全人抗IGF1R抗體)治療后出現(xiàn)了諸如中性粒細(xì)胞減少和白細(xì)胞減少等不良事件。據(jù)報(bào)道,淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的細(xì)胞表面IGF1R表達(dá)均較低,這使得它們不易被IGF1R靶向的CAR-T細(xì)胞識(shí)別。此外,可通過(guò)改變CAR-T細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的親和力或調(diào)整CAR-T細(xì)胞的治療劑量來(lái)解決靶外毒性。然而,在實(shí)現(xiàn)其臨床應(yīng)用之前,應(yīng)該對(duì)IGF1RCAR-T細(xì)胞的非靶向毒性進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)估。

ROR 1

ROR1是二十個(gè)不同的RTK家族之一,由三個(gè)不同的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域組成,包括免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域、富含半胱氨酸(CRD)和Kringle(KNG)結(jié)構(gòu)域以及細(xì)胞內(nèi)TK結(jié)構(gòu)域。ROR1在正常人組織中不表達(dá),但在幾種人類惡性腫瘤中過(guò)度表達(dá),可能作為腫瘤細(xì)胞的生存因子。

ROR1靶向CAR-T細(xì)胞的體外和體內(nèi)抗肉瘤活性已得到了證實(shí),此外,ROR1靶向CAR-T細(xì)胞的安全性已在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中進(jìn)行了驗(yàn)證。然而,最近的研究表明,ROR1的表達(dá)并不特定于腫瘤組織。已經(jīng)在人類甲狀旁腺、胰島和腸道的幾個(gè)區(qū)域觀察到細(xì)胞表面ROR1,并且在胃竇和胃體中尤其豐富。

Shivani Srivastava等人設(shè)計(jì)了一種邏輯門控ROR1CAR-T,可以解決靶向外毒性問(wèn)題。在這種設(shè)計(jì)中,CAR-T細(xì)胞活性僅消除同時(shí)表達(dá)抗原A和B的腫瘤。針對(duì)抗原A的合成Notch受體可誘導(dǎo)針對(duì)特異性抗原B的CAR表達(dá),通過(guò)整合多種信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能,從而可以更精確地區(qū)分腫瘤組織和正常組織。盡管上述研究已證明ROR1靶向的CAR-T細(xì)胞在治療EWS方面具有一定的療效,但ROR1靶向的CAR-T細(xì)胞尚未進(jìn)入臨床試驗(yàn),最新進(jìn)展正在進(jìn)行招募(NCT02706392),其顯示出巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

GD2

GD2是一種具有嚴(yán)格限制表達(dá)模式的細(xì)胞表面分子,在EWS中高度表達(dá)。由于GD2在正常組織中的分布有限,因此免疫靶向是安全的。一項(xiàng)研究證明了GD2靶向的CAR-T細(xì)胞對(duì)EWS細(xì)胞具有強(qiáng)大的細(xì)胞溶解反應(yīng),另一項(xiàng)研究也證實(shí)了GD2靶向CAR-T細(xì)胞對(duì)EWS的抗腫瘤活性。

然而,其他研究表明,僅GD2靶向的CAR-T細(xì)胞不能消除轉(zhuǎn)移性或原位注射的EWS細(xì)胞。在一項(xiàng)I期研究中,研究人員使用GD2靶向CAR-T細(xì)胞治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者,發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用GD2靶向CAR-T細(xì)胞治療沒(méi)有客觀的臨床反應(yīng)。因此,增強(qiáng)GD2靶向CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤作用是其成功臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。一種策略是將GD2與其他可行靶點(diǎn)結(jié)合,構(gòu)建表達(dá)多種CAR的T細(xì)胞。另一種方法可以將GD2靶向的CAR-T細(xì)胞與免疫檢查點(diǎn)抑制劑結(jié)合,以提高療效。

B7-H3(CD276)

B7-H3是B7免疫調(diào)節(jié)蛋白家族的成員,在多種實(shí)體瘤細(xì)胞過(guò)表達(dá)。B7蛋白與CD28/CTLA-4家族成員結(jié)合,在T細(xì)胞激活中作為共刺激信號(hào)。此外,B7-H3在病理性血管生成過(guò)程中過(guò)度表達(dá),這可能使其成為選擇性破壞腫瘤血管系統(tǒng)的有吸引力的靶點(diǎn)。

近年來(lái),利用B7-H3靶向CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤受到了廣泛關(guān)注。在胰腺導(dǎo)管腺癌、卵巢癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤小鼠模型的體外原位和轉(zhuǎn)移異種移植物中,B7-H3靶向CAR-T細(xì)胞顯示出良好的療效,沒(méi)有明顯的不良反應(yīng)。

Robbie GM等人嘗試使用B7-H3靶向的CAR-T細(xì)胞治療兒童實(shí)體瘤。他們發(fā)現(xiàn),超過(guò)90%的受試兒童肉瘤存在B7-H3和EWS的高表達(dá)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明,B7-H3靶向的CAR-T細(xì)胞可以在體內(nèi)消滅EWS異種移植物,與小鼠治療對(duì)照組相比,具有顯著的生存優(yōu)勢(shì)。因此,B7-H3靶向CAR-T細(xì)胞可能是治療EWS的可行選擇。

此外,B7-H3靶向CAR-T細(xì)胞與免疫檢查點(diǎn)抑制劑或傳統(tǒng)化療藥物的聯(lián)合似乎是一種可行的選擇。

EphA2

Eph家族成員參與細(xì)胞轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移和血管生成。有兩類Eph受體配體:ephrin-A和ephrin-B。EphA2在多種癌癥中過(guò)表達(dá),包括乳腺癌、黑色素瘤和前列腺癌。相關(guān)研究表明EphA2在EWS細(xì)胞中上調(diào),并參與內(nèi)皮細(xì)胞向腫瘤的遷移,以協(xié)助腫瘤血管生成。

研究表明,EphA2靶向的CAR-T細(xì)胞能有效殺死小鼠的EWS細(xì)胞,并與延長(zhǎng)存活時(shí)間有關(guān)。然而,只有一小部分EWS細(xì)胞表達(dá)EphA2,EphA2CAR-T細(xì)胞在小鼠中表現(xiàn)出的抗腫瘤活性可能主要通過(guò)作用于腫瘤血管生成來(lái)影響EWS的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

NKG2D

NKG2D是一種由自然殺傷(NK)細(xì)胞和T細(xì)胞表達(dá)的強(qiáng)大激活受體。近年來(lái),NKG2D及其配體在EWS中的作用越來(lái)越受到關(guān)注。

Manfred Lehner等人通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)或mRNA轉(zhuǎn)染構(gòu)建了NKG2D特異性CAR-T細(xì)胞,這些CAR-T細(xì)胞在體外可以有效地消除EWS細(xì)胞。此外,組蛋白去乙�；�酶抑制劑可上調(diào)EWS中NKG2D配體的表達(dá)。因此,NKG2D特異性CAR-T細(xì)胞和組蛋白去乙�；�酶抑制劑的組合被認(rèn)為是EWS的有效治療方法。

總結(jié)與展望

CAR-T細(xì)胞治療是一種很有前途的免疫治療方法,對(duì)血液和淋巴系統(tǒng)腫瘤的治療效果令人鼓舞。同時(shí),人們也對(duì)CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤充滿了期待,EWS是一種侵襲性的兒童癌癥,CAR-T療法可能在EWS患者中發(fā)揮優(yōu)越的抗腫瘤作用。一些CAR-T細(xì)胞治療EWS的研究已經(jīng)取得了一些令人鼓舞的進(jìn)展。

目前,用于CAR-T細(xì)胞的抗原表位主要包括VEGFR2、IGF1R、ROR1、GD2、B7-H3、EphA2和NKG2D。盡管針對(duì)這些靶點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞在體外或體內(nèi)臨床前模型中表現(xiàn)出抗腫瘤活性,但這些靶點(diǎn)也有其局限性,如靶點(diǎn)外毒性、作用不足和低表達(dá),大多數(shù)研究還處于早期,離臨床應(yīng)用還較遠(yuǎn)。

解決以上問(wèn)題,CAR-T細(xì)胞治療應(yīng)該注意以下幾個(gè)方面:首先,尋找對(duì)腫瘤更具特異性的靶點(diǎn);其次,當(dāng)靶點(diǎn)在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)而在正常細(xì)胞中低表達(dá)時(shí),通過(guò)控制治療閾值可以減少對(duì)正常組織的損傷。第三,可以調(diào)整CARs和同源抗原之間的親和力以實(shí)現(xiàn)靶向性。

針對(duì)CAR-T細(xì)胞治療的障礙,如腫瘤穿透、抗殺傷、抗原逃逸和免疫抑制,可以從以下幾個(gè)方面加以解決。1)CAR-T細(xì)胞可以被設(shè)計(jì)成表達(dá)趨化因子受體,以識(shí)別TME中上調(diào)的趨化因子,從而增加CAR-T細(xì)胞的浸潤(rùn)。2)CAR-T細(xì)胞與常規(guī)療法或免疫檢查點(diǎn)抑制劑的結(jié)合可能值得探索。3)構(gòu)建表達(dá)多個(gè)CAR的免疫細(xì)胞或結(jié)合多個(gè)CAR-T細(xì)胞可提供更高的腫瘤細(xì)胞破壞效率。4)可以將更多的共刺激表達(dá)受體引入CAR-T細(xì)胞,并且可以構(gòu)建靶向腫瘤抗原和免疫抑制細(xì)胞因子或TME中的免疫抑制細(xì)胞的CAR-T細(xì)胞,以抵抗對(duì)T細(xì)胞的腫瘤免疫抑制作用。5)聯(lián)合某些藥物可以通過(guò)表觀遺傳學(xué)上調(diào)腫瘤中抗原的表達(dá),并增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷作用。

參考文獻(xiàn):

1．A Novel Treatment forEwing’s Sarcoma: Chimeric Antigen Receptor-T Cell Therapy． Front Immunol． 2021;12: 707211．