前言

幾十年來,盡管有許多新的突破性的療法發(fā)現(xiàn),心血管疾病依然是世界上發(fā)病率和死亡率最高的首要因素。在過去的20年里,一些治療干預措施已經(jīng)得到了臨床應(yīng)用,包括基于細胞的治療;然而,細胞移植在心臟組織缺血環(huán)境中的存活率和植入率低,這限制了它們的臨床療效。從機理上講,細胞療法觀察到的功能改善的原因尚不清楚;然而,實驗數(shù)據(jù)表明,它們可能通過旁分泌發(fā)揮作用,由外泌體(EVs)或其他因子介導。因此,目前人們對開發(fā)基于外泌體的無細胞療法的興趣與日俱增。

EVs是由脂質(zhì)雙層包圍的細胞外結(jié)構(gòu),幾乎所有已知的細胞類型都分泌。EVs包括兩大類胞外體(exosome)和微泡(microvesicles)。胞外體(直徑30-150nm)是由多囊胞內(nèi)體的膜內(nèi)陷形成的腔內(nèi)囊泡,在多囊胞內(nèi)體與細胞膜融合后釋放到細胞外空間。微泡(直徑50-1000nm)是一組高度異質(zhì)的EV,其特征是通過質(zhì)膜向外發(fā)芽,從而產(chǎn)生和分泌。

EV攜帶蛋白質(zhì)、RNA和/或microRNAs(miRNAs)等分子,在細胞間通訊中起著載體的作用。大量證據(jù)表明,EVs參與許多生理和病理性心血管過程,包括血管生成的調(diào)節(jié);血壓控制;心肌細胞肥大凋亡和/或存活;以及心肌纖維化。由于EV普遍存在于體液中,如血液和尿液,EV已被用作心血管疾病的潛在生物標志物。此外,由于EVs是干細胞治療的旁分泌效應(yīng)的重要組成部分,EVs可作為心血管疾病的獨立療法。臨床前研究已顯示了EVs在保護心臟免受缺血損傷以及促血管生成等方面的治療潛力。

EVs的生物物理特性

大小:大小是用于對EVs進行分類的參數(shù)之一。一般來說,胞外體比微泡小,大小分布更均勻。EVs尺寸對于其研究和應(yīng)用至關(guān)重要,因為大多數(shù)分離和鑒定的操作步驟都依賴于EVs的密度和直徑大小。此外,EV的大小是由它們的發(fā)生途徑所決定的,與EV的成分相關(guān)。最后,EVs的組織生物分布、細胞內(nèi)化和細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的效率取決于大小。例如,在給藥后大的(>200nm)和聚合的外泌體會停留在肺、肝和脾中,最后被巨噬細胞吞噬或者因無法滲透而與非血管的細胞和組織發(fā)生作用。

在細胞水平上,不同大小的顆�？梢哉T發(fā)不同的攝取機制。例如,直徑為100nm的顆�？赏ㄟ^網(wǎng)格蛋白介導或細胞質(zhì)膜微囊介導的內(nèi)吞作用被吸收,而更大的聚集體更可能被導向溶酶體降解或膜再循環(huán)。因此,較小的囊泡可能往細胞內(nèi)輸送的效率更高。在心臟環(huán)境中,尤其是對于全身給藥的EV,這一因素至關(guān)重要,因為EVs必須成功地滲入心臟組織,然后被相關(guān)細胞類型有效地吸收。

電荷:EVs的另一個重要特性是表面電荷。由于EV膜的一部分成分來自富含磷酸鹽的質(zhì)膜(剩余部分來自其他細胞器,包括高爾基體),因此EVs通常帶凈負電荷,細胞也是如此。然而,電荷也高度依賴于質(zhì)膜的糖組成,而這又取決于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中唾液酸轉(zhuǎn)移酶(將唾液酸轉(zhuǎn)化為低聚糖的酶)的表達水平。表面電荷的變化可以用來推斷EVs在懸浮狀態(tài)下的穩(wěn)定性,因為絕對值較低的話,可能會減少斥力而使EVs更容易聚集。EV的大小和表面電荷對于確定EV和許多潛在配體之間的相互作用機制以及靶細胞對它們的吸收至關(guān)重要。最后,EV樣品中存在的污染物(如蛋白質(zhì)或脂類聚集體)可能會影響各種功能和參數(shù)�？紤]到這些污染物表面電荷的不均勻性,它們和EVs之間會形成聚集體。因此,必須遵循適宜的純化方案。

膜的成分:胞外體膜的膽固醇含量比供體細胞膜高,這使它們不易受到小分子物質(zhì)的滲透。此外,與供體細胞膜相比,胞外體膜含有較高水平的磷脂酰絲氨酸、鞘糖脂和鞘磷脂,而磷脂酰膽堿含量較低。與微泡相比,胞外體具有較低的蛋白脂質(zhì)比。事實上,高膽固醇和鞘脂含量使得胞外體比微泡更耐洗滌劑和高溫。胞外體除了具有脂類成分外,還被蛋白質(zhì)和糖修飾,這些蛋白質(zhì)和糖有助于胞外體的電荷和膜結(jié)構(gòu)的維持,并介導胞外體與靶細胞之間的相互作用。例如,tetraspanins是一類膜蛋白,大量存在于胞外體中,其中一些(CD9、CD63和CD81)被認為是胞外體的一般標記物。從功能上講,tetraspanins參與膜融合和細胞粘附,因此在胞外體內(nèi)化中起著重要作用。其他種類的蛋白質(zhì),如趨化因子受體(例如,CXC趨化因子受體4)、粘附分子和蛋白多糖(如硫酸乙酰肝素蛋白聚糖),已被證明在介導EV與細胞表面的相互作用中起作用。當這些以蛋白質(zhì)和糖為基礎(chǔ)的成分被去除或掩蓋時,EV內(nèi)化和生物分布就會改變。EVs的跨膜蛋白與分泌細胞的結(jié)構(gòu)相同,這就賦予了一定程度的細胞特性和可能的趨化性。

內(nèi)含物:從20世紀90年代末開始,EVs被認為是細胞間通訊的重要介質(zhì),特別是在免疫應(yīng)答和癌癥方面。2007年發(fā)現(xiàn)胞外體含有miRNAs和其他類型的RNA,并能將其內(nèi)含物轉(zhuǎn)移到靶細胞,最終影響這些細胞的活性,這一概念在2007年得到進一步驗證。采用高分辨率密度梯度分餾和直接免疫親和分析的研究進一步剖析了EVs的成分。EVs在管腔中含有多種蛋白質(zhì)和RNA,包括長的和小的非編碼RNA、轉(zhuǎn)移RNA和核糖體RNA。胞外體不含DNA,盡管由于與組蛋白共沉淀,DNA可能存在于較大的EV或富含胞外體的樣本中。蛋白質(zhì)可以通過翻譯后修飾(如泛素化和糖基化)進入到EVs,并且這些途徑可以用作攜帶靶向蛋白質(zhì)進入EVs。對EV蛋白之間功能性建立的相互作用網(wǎng)絡(luò)的研究表明,囊泡內(nèi)的蛋白質(zhì)高度有序地組成一個“納米宇宙”,而不僅僅是一個無序的“胞內(nèi)碎片”的集合。

用于心血管疾病治療的天然EVs

第一項使用EVs作為心血管疾病的潛在治療干預的研究,發(fā)表于2010年。在21世紀初,一些研究小組表明,移植不同類型的細胞,包括間充質(zhì)干細胞和造血祖細胞或干細胞(CD34+細胞),可以改善心肌梗死(MI)后的心臟修復。隨后,這些干細胞或祖細胞的積極作用被證明不是通過來自植入細胞的直接貢獻,而是通過旁分泌因子,特別是由存活細胞分泌的EVs介導的。

自這些開創(chuàng)性研究以來,有幾個研究小組已經(jīng)證明了在MI、肢體缺血和慢性皮膚損傷的情況下,干細胞或祖細胞以及分化的體細胞分泌的EV的再生特性。一些研究已經(jīng)在動脈粥樣硬化性硬化和中風中進行,但是大多數(shù)關(guān)于EVs的心血管研究都與缺血性心臟病和MI有關(guān)。EV追蹤研究表明,與冠狀動脈內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥相比,EVs心肌內(nèi)給藥可產(chǎn)生更高的EV在心臟內(nèi)的滯留。目前收集到的臨床前數(shù)據(jù)表明,無論其來源如何,EVs都能改善左室射血分數(shù)(比未治療組增加1．3倍),并減少心肌梗死面積(與未治療組相比減少3倍)。對EVs與供體細胞的治療效果進行了評估,迄今收集的結(jié)果表明,在MI的情況下,EVs與供體細胞一樣有效。

EVs在受體細胞中的治療作用主要歸因于蛋白質(zhì)和/或非編碼RNA,特別是miRNA的傳遞。例如,被認為參與胞外體的心血管保護作用的miRNA包括miRNA-19a-3p、miRNA-21、miRNA-22、miRNA-24、miRNA-29a、miRNA-126、miRNA-143、miRNA-146、miRNA-181b、miRNA-210、miRNA-222和miRNA-294-3p等。在以前的細胞治療研究中,一些miRNA(包括miRNA-19、miRNA-21、miRNA-24和miRNA-210)已經(jīng)被確認與心血管修復相關(guān),而其他的miRNA則是新發(fā)現(xiàn)的。

與EVs生物活性相關(guān)的另一個重要成分是蛋白質(zhì),如血小板衍生生長因子D和pappalysin1。其中一些蛋白質(zhì)位于EV表面,因此不需要傳遞到受體細胞的細胞質(zhì)中。例如,pappalysin 1在心臟祖細胞的胞外體中高度表達,Pappalysin 1通過將胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4裂解為胰島素樣生長因子1(IGF-1),進而激活I(lǐng)GF-1受體,導致AKT、ERK1和ERK2磷酸化以及隨后caspase激活和心肌細胞凋亡的降低,從而介導來自心臟祖細胞的EVs的心臟保護和血管生成作用。

根據(jù)EV的來源和含量,它們可以觸發(fā)各種心臟保護作用,例如通過調(diào)節(jié)自噬改善心肌細胞和內(nèi)皮細胞存活;激活促生存信號通路(例如涉及AKT、ERK和Toll樣受體的信號通路)和氧化應(yīng)激水平的降低;通過影響免疫細胞極化(即誘導更具修復性的狀態(tài)而不是炎癥狀態(tài))和細胞因子分泌以及增加CD4+T細胞的活化來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng);瘢痕含量減少;血管生成刺激。例如,心臟衍生的EVs通過miRNA-146改善了MI小鼠模型的心臟功能,減少了細胞凋亡和炎癥反應(yīng),增加了心肌細胞增殖和血管生成。細胞外基質(zhì)衍生的EV攜帶miRNA-199a-3p,通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子GATA4的乙�；�,恢復了生物工程化心房的電功能。

EVs的生物工程化

上述研究強調(diào)了天然EVs在心血管治療中的潛力。然而,它們的臨床潛力尚未被認識到,在它們成為一種有效的治療工具之前必須克服重要的局限性。這些限制可以通過使用生物工程技術(shù)來改善EVs的性能來解決。因此,為了提高天然EVs在治療心血管疾病方面的療效,人們開發(fā)了調(diào)節(jié)EVs并提高其生物活性、穩(wěn)定性、靶向性和向心血管系統(tǒng)轉(zhuǎn)送(通過開發(fā)EVs運載系統(tǒng))的技術(shù)。

追蹤:在體追蹤EVs并跟蹤其生物分布對評價其心血管治療潛力具有重要意義。熒光,發(fā)光物,PET–MRI和SPECT成像技術(shù)已被用于體內(nèi)監(jiān)測EV,通常在分離EVs后會用化學配體修飾。雖然熒光和發(fā)光成像技術(shù)易于操作,但它們不能提供高靈敏度或絕對定量。相比之下,依賴于PET-MRI或SPECT-CT的方法提供了更高的靈敏度和絕對定量,也允許獲取具有解剖細節(jié)的圖像。一般來說,靜脈注射從不同細胞源分離的標記EV(除了標記外沒有進一步的修飾)不會導致心臟受損。然而,EVs在心臟的蓄積受輸送途徑、輸送濃度和EV分泌細胞特性的影響。

生物活性:① 調(diào)節(jié)EV分泌細胞。EV分泌細胞可通過兩種不同的程序進行調(diào)節(jié):在應(yīng)激誘導條件下(如低氧、血清饑餓或炎癥)培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染外源化合物(如核酸,尤其是miRNAS23、miRNA拮抗劑、Y RNA、質(zhì)粒DNA和小分子以增加其生物活性)。例如,從缺氧條件下培養(yǎng)的大鼠心臟祖細胞中收集的EVs與正常收集的EVs相比,增加了體外培養(yǎng)的心臟內(nèi)皮細胞形成管狀結(jié)構(gòu)的能力,降低了體外培養(yǎng)的心臟成纖維細胞中促纖維化基因的表達,改善了梗死心臟的功能。此外,從轉(zhuǎn)染miRNA-181a的人骨髓間充質(zhì)干細胞收集的EV增加了外周血單個核細胞的修復狀態(tài),并且在心肌內(nèi)注射到遭受缺血-再灌注損傷的小鼠心臟后,與基線相比,富含miRNA-181a的EVs增加了12%的左心室射血分數(shù)。

② EV分泌細胞也可以通過改變培養(yǎng)基來調(diào)節(jié)。例如,從內(nèi)皮分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)的人脂肪干細胞中收集的EV中miRNA-31水平增加。與在正常培養(yǎng)基中生長的脂肪源性干細胞收集的EVs相比,產(chǎn)生的EVs促進了內(nèi)皮細胞的遷移、管腔的形成和主動脈環(huán)的生長。一些細胞平臺已經(jīng)被開發(fā)出來,用特定的蛋白質(zhì)和RNA來定制EVs的富集;然而,這些平臺還沒有被評估用于心血管疾病應(yīng)用。此外,很少有研究利用細胞機制來設(shè)計具有特定表位的ev,以靶向心臟。

③ 分離后修飾方法。使用細胞修飾機制來生產(chǎn)EVs的好處是保留了EVs的大部分生物物理特性,但也有缺點——在細胞中過度表達某個特定分子可能會對其生物學產(chǎn)生無法預料的后果,最終干擾EVs的生物發(fā)生。使用EVs分離后修飾的策略為EVs的有效生物工程裝載、靶向和輸送提供了替代方法,而不用考慮其來源細胞。然而,分離后修飾的方法可能掩蓋或損害內(nèi)源性EV特性,最終損害EV的生物活性。

膜滲透策略,如電穿孔、熱休克或凍融程序、洗滌劑處理和超聲波等,以加載外源材料,這些策略已經(jīng)應(yīng)用于EVs上,成功率參差不齊。其他策略包括被動加載,利用EV膜的疏水性將感興趣的化合物被動地加載到EVs中,以及用膽固醇修飾感興趣的分子。這些研究報告了高達70%的負載效率,但對EVs的生物物理特性的影響和確切的作用機制仍有待闡明。

使用轉(zhuǎn)染劑或膜通透性策略對幾種EV制劑進行了富集,并在心血管疾病的背景下對其進行了評估,以減少心臟纖維化、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和增加血管生成。例如,miRNA-21-5p在心肌梗死后纖維化的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用,它調(diào)節(jié)包括MMP2、PTEN和SMAD7在內(nèi)的多個基因靶點。與使用未修飾的EVs相比,富含miRNA-21抑制劑的人外周血衍生EVs可減少MI小鼠模型的纖維化。在一項單獨的研究中,從心臟祖細胞衍生細胞中收集EV,通過電穿孔法富含miRNA-322,并系統(tǒng)地注射到MI小鼠模型中,與未經(jīng)修飾的EVs相比,可減少心肌梗死面積和纖維化,并增加血管生成。綜上所述,這些研究證明了分離后富集EVs的可能性,從而提高了其與未修飾EVs相比的生物活性。

分布和生物靶向:在對動物模型進行全身給藥后,EVs很快被清除或集中在肝臟、脾臟和肺臟中,EVs的半衰期(通常在分鐘范圍內(nèi))本質(zhì)上取決于EVs分泌細胞的來源。EV的生物分布受多種因素的影響,包括給藥途徑和劑量。如之前在細胞療法中觀察到的,保留在多個器官中的EV可能會誘導全身性抗炎作用,提高心血管系統(tǒng)的再生能力。然而,研究清楚地表明EV療效的提高與EV在病變區(qū)域的滯留有關(guān)。因此,人們開發(fā)了幾種策略來控制EV的生物分布,并將EV靶向特定的器官和組織。

使EVs攝取量最大化的一個策略是增加其在循環(huán)中的穩(wěn)定性,從而提高EVs與目標細胞或組織之間相互作用的可能性。用聚乙二醇修飾EVs增加了其循環(huán)時間并減少了非特異性細胞對其的吸收。另一種策略依賴于用特異性蛋白或肽對EV膜進行修飾,這些蛋白可以與心血管系統(tǒng)中表達的特定細胞受體或細胞外基質(zhì)成分相互作用。一些例子包括靶向腦缺血區(qū)域的環(huán)肽(RGDyK)、靶向神經(jīng)元的溶酶體相關(guān)膜糖蛋白2B(LAMP2B)–RVG結(jié)構(gòu)物、靶向缺血心肌的CSTSMLKAC肽和靶向心肌細胞的WLSEAGPVVTVRALRGTGSW肽。Tetraspanins蛋白存在于EV膜中并且優(yōu)先與特定細胞系結(jié)合(例如,Tetraspanins蛋白與內(nèi)皮細胞表達的整合素α4β4鏈結(jié)合),但這些蛋白質(zhì)可能不足以選擇性和有效地將EVs靶向器官或組織。

在心臟病的病例中,臨床前研究中已經(jīng)報道了EVs的心肌內(nèi)給藥;然而,這種給藥途徑在臨床上并不總是可取的,因為它涉及到導管插入術(shù)。靜脈注射EVs是一個簡單得多的程序,并允許重復應(yīng)用;然而,這種方法更容易偏離靶點結(jié)合,增加不良反應(yīng)的可能性。經(jīng)過改造的EVs最終可能會克服這些障礙,將它們的治療藥物運送到受傷的心臟。有兩種方法被用來修飾EVs的表面,使其靶向心臟。在一種方法中,對EV分泌細胞進行基因改造以表達肽,然后將其并入分泌的EVs膜中。例如,EV分泌細胞已經(jīng)用慢病毒載體進行了基因修飾,該結(jié)構(gòu)表達融合了肽(CSTSMLKAC)的膜蛋白(LAMP2B),從而靶向缺血心肌細胞。雖然沒有EVs在心臟中積累的絕對定量,但熒光成像顯示肽修飾的EVs比沒有表面修飾的EVs積累的更多。

在另一種方法中,可通過兩種主要策略對EVs表面進行化學修飾:將經(jīng)蛋白質(zhì)(例如鏈霉親和素)或肽修飾的脂質(zhì)物理結(jié)合到EVs的膜中,以及將連接物化學偶聯(lián)于EVs表面的官能團(羧基或胺基)。這些反應(yīng)可以在水溶液中進行,與傳統(tǒng)的生物結(jié)合技術(shù)相比,具有快速、選擇性和非常高效的特點。例如,心肌梗死后將經(jīng)心肌靶向肽(CSTSMLKAC)修飾的EVs注射到小鼠,左心室射血分數(shù)增加了46%。

EVs分泌細胞的遺傳修飾和化學方法修飾對EVs各有利弊�；�因方法可能會產(chǎn)生一種更標準化的產(chǎn)品,這對于滿足監(jiān)管預期是可取的。然而,這種策略有一些局限性,包括由于基因操縱導致的EVs生物活性的變化,以及難以控制靶向表位的密度及其糖基化狀態(tài)�；瘜W方法可以允許有效地控制EV表面修飾的結(jié)構(gòu)(包括防止肽降解的非天然氨基酸)和靶向表位的密度,而不考慮其來源細胞。另外,化學方法可以在EVs的純化過程中進行,因此,其更適合臨床應(yīng)用。

攝取和細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運:利用熒光成像技術(shù)和標記的EVs可以研究EVs的內(nèi)化和細胞內(nèi)運輸。EVs的細胞內(nèi)吞作用似乎受到EVs與細胞膜的相互作用以及受體細胞的內(nèi)吞能力的影響。EVs的內(nèi)化可以通過非特異性的相互作用,也可以通過特定的相互作用,如受體依賴性途徑來介導。關(guān)于細胞內(nèi)吞能力的差異、EV表面修飾對細胞內(nèi)運輸?shù)挠绊懸约癊V表面修飾可能增加內(nèi)溶酶體逃逸的影響,目前還知之甚少。然而,這些問題是至關(guān)重要的,因為大部分內(nèi)化的EV在內(nèi)溶酶體途徑中被加工,最終在溶酶體中降解。實際上,大約60%的內(nèi)化EV在與受體細胞接觸48小時后定位于溶酶體。

有人提出了增加EVs內(nèi)溶酶體逃逸的策略。在一種方法中,EVs被陽離子脂質(zhì)和pH敏感的融合肽包被,這增加了內(nèi)溶酶體膜的破壞,從而導致EV內(nèi)容物的有效胞漿釋放。在另一種方法中,EVs被精氨酸細胞滲透肽包裹,以誘導活躍的微胞飲作用,并更有效地將EVs釋放到細胞漿中。

傳送:在損傷部位局部給藥EVs可增加靶向細胞和靶細胞攝取的可能性。已經(jīng)開發(fā)了幾種基于生物材料的策略從而在損傷部位持續(xù)釋放EV,包括含有透明質(zhì)酸、藻酸鹽、殼聚糖、膠原或兩親性肽的水凝膠。水凝膠組合物的設(shè)計考慮了其生物學、降解、原位凝膠化特性、機械和EV釋放特性。通過幾種方法將EVs摻入水凝膠中。在一種方法中,EV與聚合物溶液混合而不涉及兩個實體之間的反應(yīng)。然后將溶液注入感興趣的組織中,并在幾分鐘內(nèi)通過分子間的相互作用、分子間離子相互作用或聚合物疏水鏈介導的自組裝過程將聚合物物理交聯(lián),從而將EVs保留在聚合物結(jié)構(gòu)內(nèi)。

在另一種方法中,EV與聚合物溶液混合形成聚合物-EV共軛物并啟動化學交聯(lián)過程。然后將溶液注入感興趣的組織,以進一步交聯(lián)并形成水凝膠。在第三種方法中,EVs在聚合后被物理地并入水凝膠。與沒有緩釋系統(tǒng)的EVs相比,EV釋放水凝膠增加了左室射血分數(shù),縮小了梗死面積,減少了心律失常負擔。例如,用含EVs的水凝膠貼片治療的大鼠梗死心臟的左心室射血分數(shù)分別比不含EVs的對照組和單獨接受EVs的對照組動物高40%和25%。重要的是,從水凝膠中釋放EV的動力學似乎對其治療效果有重要作用。例如,植入小鼠皮膚傷口的水凝膠緩慢釋放EVs不如使用遠程觸發(fā)水凝膠在皮膚再生過程中協(xié)同釋放EVs有效。在這項研究中,EVs被固定在一個水凝膠中,該水凝膠可以被暴露在藍光下裂解。然后每隔一段時間將傷口暴露在藍光下(這可以根據(jù)傷口的愈合率而改變),以觸發(fā)部分水凝膠降解和EVs的控制釋放。

展望

在過去的十年里,在了解EVs的生物學特性及其在心血管領(lǐng)域的應(yīng)用方面取得了重大進展。靶向技術(shù)可以增加EVs在心血管系統(tǒng)中的積累,從而減少所需的劑量,利用特定生物分子提高EVs含量的策略可能是其成功應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵。EVs追蹤技術(shù)的使用將提高我們對EVs生物分布機制的理解。此外,將外源分子加載到EVs上并控制其體內(nèi)釋放將為提高EVs的生物活性創(chuàng)造機會。最后,生物工程化的EVs將是一個極具前景的,不依賴細胞,耐用且可定制的治療方法,以改善心血管疾病患者的結(jié)局。

參考文獻:

Native and bioengineered extracellular vesicles for cardiovascular therapeutics． Nat Rev Cardiol． 2020 Jun 1．