工程化抗體的位點(diǎn)特異性生物偶聯(lián)

生物正交化學(xué)和蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域的進(jìn)展有助于產(chǎn)生更均勻的ADC。盡管在天然單抗上有許多可用的附著方法可供選擇，但在工程化抗體上的位點(diǎn)特異性生物偶聯(lián)能夠更有效地控制DAR，并且避免改變與抗原結(jié)合的親和力。這樣，在某些位置加入天然或非天然氨基酸，得到具有優(yōu)良藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)特征的同質(zhì)產(chǎn)品。

酶法

有效載荷的附著可以通過(guò)在抗體序列中插入特定的氨基酸標(biāo)簽以非常有選擇性的方式實(shí)現(xiàn)。這些標(biāo)簽被特定的酶所識(shí)別，例如甲酰甘氨酸生成酶（FGE）、微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（MTG）、轉(zhuǎn)肽酶或酪氨酸酶，從而能夠執(zhí)行位點(diǎn)特異性偶聯(lián)。

Aaron等人探索了一種新的利用醛標(biāo)記蛋白質(zhì)的位點(diǎn)特異性偶聯(lián)。該技術(shù)利用了基因編碼的五肽序列（Cys－X－Pro－X－Arg），其中半胱氨酸殘基被FGE識(shí)別，并在細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)期間被共翻譯氧化為甲酰甘氨酸。這樣，工程化抗體通過(guò)HIPS（hydrazino－Pictet–Spengler）化學(xué)方法與醛特異性連接子選擇性偶聯(lián)。

微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（MTGase）策略也經(jīng)常被開發(fā)用于定位特異性偶聯(lián)。MTGase催化在脫糖抗體295位置的谷氨酰胺側(cè)鏈與底物的伯胺之間形成肽鍵。與其他酶策略相比，MTG是一種靈活的技術(shù)，不需要肽供體來(lái)實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)。只要�；�受體含有一種伯胺，就沒(méi)有結(jié)構(gòu)限制。

谷氨酰胺殘基自然存在于單抗的每個(gè)重鏈的Fc區(qū)域。在295位去糖基化后，谷氨酰胺殘基通過(guò)MTGase介導(dǎo)的反應(yīng)偶聯(lián)，可以產(chǎn)生均一的DAR＝2的ADC。為了提高效率，可以偶聯(lián)帶支鏈的連接子，從而使DAR翻倍，297位的天冬酰胺突變?yōu)楣劝滨０芬部稍黾覦AR。

NBE Therapeutics開發(fā)了基于S金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)肽酶A介導(dǎo)的偶聯(lián)。他們的策略利用轉(zhuǎn)肽酶A（SrtA），在LPXTG（X＝任何氨基酸）五肽的基序中切割蘇氨酸和甘氨酸殘基之間的酰胺鍵。然后，它催化甘氨酸相關(guān)的有效載荷與新生成的C－末端的偶聯(lián)，在生理溫度和pH下生成肽鍵。

該方法應(yīng)用于不同抗體，如抗CD30和抗Her2，并使用含有5甘氨酸標(biāo)記的連接子偶聯(lián)maytansine和MMAE，兩種ADC均顯示出與經(jīng)典偶聯(lián)相似的體外細(xì)胞殺傷活性。酶法產(chǎn)生的trastuzumab－maytansine在體內(nèi)試驗(yàn)中完全匹配Kadcyla。

在另一個(gè)例子中，利用轉(zhuǎn)肽酶法生成了高效蒽環(huán)素毒素衍生物PNU－159682的ADC。有趣的是，通過(guò)這項(xiàng)技術(shù)，偶聯(lián)效率甚至高于Adcetris和Kadcyla類似物。此外，所制備的PNU－159682 ADC具有較高的體外和體內(nèi)穩(wěn)定性，并且顯示出的效力超過(guò)了含有微管蛋白靶向有效載荷的ADC。

另一個(gè)新興的新方法是通過(guò)酪氨酸標(biāo)簽進(jìn)行位點(diǎn)特異性抗體標(biāo)記，酪氨酸標(biāo)簽與單克隆抗體輕鏈的C末端基因融合�？紤]到位點(diǎn)可及性，Bruins及其同事使用了一種工程化的四甘氨酰酪氨酸殘基作為標(biāo)記，它為偶聯(lián)提供了一個(gè)容易觸及的位點(diǎn)。酪氨酸酶將酪氨酸氧化成1，2－醌，從而允許與各種雙環(huán)［6．1．0］壬炔（BCN）衍生物的環(huán)加成反應(yīng)。這種方法可以與含有BCN連接子的MMAE有效地偶聯(lián)。

半胱氨酸工程：硫單抗技術(shù)

隨機(jī)半胱氨酸偶聯(lián)和重橋接是利用抗體結(jié)構(gòu)內(nèi)天然存在的半胱氨酸殘基的技術(shù)。然而，隨機(jī)半胱氨酸方法的異質(zhì)性以及重橋接策略中的單抗片段化需要在ADC合成中加以考慮，特別是當(dāng)疏水性藥物被偶聯(lián)時(shí)。

與它們不同的是，硫單抗技術(shù)通過(guò)利用不涉及結(jié)構(gòu)二硫鍵的工程化反應(yīng)性半胱氨酸，在抗體上實(shí)現(xiàn)所需位點(diǎn)的選擇性和均勻修飾。一般來(lái)說(shuō)，半胱氨酸突變的設(shè)計(jì)是為了促進(jìn)細(xì)胞毒性有效載荷偶聯(lián)的同時(shí)，保持單克隆抗體的穩(wěn)定性、親和力和最小化ADC聚集。為了確定突變的最佳位置，通常采用幾種技術(shù)，包括計(jì)算建模、模型系統(tǒng)篩選和高通量掃描。

Junutula等人首先報(bào)道了一種硫單抗策略，用工程化半胱氨酸殘基取代了抗MUC16抗體重鏈114位的丙氨酸（HC－A114），工程化位置內(nèi)的反應(yīng)性硫醇能夠與馬來(lái)酰亞胺負(fù)載的連接子反應(yīng)。合成的抗MUC16 ADC在異種移植小鼠模型中表現(xiàn)出效力，在大鼠和食蟹猴中表現(xiàn)出高劑量耐受性，這個(gè)發(fā)現(xiàn)建立了硫單抗偶聯(lián)策略的一般性方法。

此外，琥珀酰亞胺連接在胞漿內(nèi)可以經(jīng)歷兩個(gè)平行反應(yīng)：反向Michael反應(yīng)導(dǎo)致連接子－有效載荷的損失，以及琥珀酰亞胺的水解，這兩種反應(yīng)都對(duì)體內(nèi)ADC活性有顯著影響。為了提高穩(wěn)定性，Lyon和合作者設(shè)計(jì)了一個(gè)與馬來(lái)酰亞胺相鄰的堿性氨基整合進(jìn)來(lái)的連接子。在連接子中加入二氨基丙酸（DPR）促進(jìn)了硫琥珀酰亞胺在中性pH和室溫下的快速定量水解，這樣，非特異性的去偶聯(lián)作用被阻止，從而提高了體內(nèi)的穩(wěn)定性。除了常用的馬來(lái)酰亞胺外，還探索了不同的半胱氨酸反應(yīng)劑，如碘乙酰胺、溴甲酰胺、羰基丙烯酸酯，N－烷基乙烯基吡啶鹽。

與工程化非天然氨基酸的生物偶聯(lián)

除了硫單抗技術(shù)外，非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸（ncAA）的加入為位點(diǎn)特異性偶聯(lián)提供了另一種可能性。該技術(shù)使用含有獨(dú)特化學(xué)結(jié)構(gòu)的氨基酸，從而能夠以化學(xué)選擇性的方式引入連接子－有效載荷復(fù)合物。該技術(shù)需要對(duì)抗體序列重組，利用與宿主細(xì)胞內(nèi)所有內(nèi)源性tRNAs和合成酶正交的tRNA和氨基酰tRNA合成酶（aaRS），用于響應(yīng)未賦值密碼子將ncAA帶入蛋白質(zhì)。通常，ncAA在發(fā)酵過(guò)程中被添加到培養(yǎng)基中。選擇非天然氨基酸是很重要的，因?yàn)樗鼈兛赡芗ぐl(fā)免疫原性。常用的ncAA是具有獨(dú)特基團(tuán)的天然氨基酸的類似物，如酮、疊氮、環(huán)丙烯或二烯。

已有研究將對(duì)乙酰苯丙氨酸（pAcF）成功地整合入抗CXCR4 抗體中。有效載荷Auristin通過(guò)肟連接與抗體有效偶聯(lián)，從而生成化學(xué)均一的ADC。該ADC在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出良好的體外活性和完全清除肺腫瘤的作用。

由于肟連接所需的酸性條件和ADC緩慢釋放的動(dòng)力學(xué)，另一種選擇是加入含ncAA的疊氮化物。廣泛應(yīng)用的對(duì)疊氮哌苯胺（pAzF）可在生理?xiàng)l件下快速進(jìn)行CuAAC或SPAAC反應(yīng)，利用這種策略成功地在抗CD74抗體上偶聯(lián)糖皮質(zhì)激素有效載荷。除了pAcF技術(shù)外，還成功地將含疊氮的賴氨酸類似物（AzK）帶入到抗體中，以產(chǎn)生具有Auristin、PBD二聚體或微管蛋白有效載荷的位點(diǎn)特異性ADC。

此外，賴氨酸的環(huán)丙烯衍生物（CypK）以及自然發(fā)生的非典型氨基酸，如硒代半胱氨酸（Sec）都成功地整合進(jìn)入抗體中。所產(chǎn)生的ADC表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性、選擇性以及體外和體內(nèi)活性。

小結(jié)

在過(guò)去的幾年里，ADC的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和機(jī)制擴(kuò)展方面取得了許多進(jìn)展。新的偶聯(lián)技術(shù)已經(jīng)被開發(fā)出來(lái)，以獲得對(duì)腫瘤的更高選擇性。這些偶聯(lián)技術(shù)使ADC具有更好的穩(wěn)定性、選擇性以及體外和體內(nèi)活性。這些新型偶聯(lián)技術(shù)的初步數(shù)據(jù)令人鼓舞，未來(lái)將極大地促進(jìn)ADC藥物的迅猛發(fā)展。

參考文獻(xiàn)：

1．The Chemistry Behind ADCs． Pharmaceuticals （Basel）． 2021 May； 14（5）： 442．

       原文標(biāo)題 : ADC生物偶聯(lián)技術(shù)的最新研究進(jìn)展