前言

在過去十年中，自體CAR－T療法徹底改變了血液腫瘤的治療模式。目前，全球已有8種不同的CAR－T療法獲得市場授權(quán)，用于治療多發(fā)性骨髓瘤（MM）和CD19＋B細(xì)胞惡性腫瘤。然而，盡管CAR－T在復(fù)發(fā)和難治性血液瘤中取得了臨床成功，但仍然面對著一些挑戰(zhàn)，如繁瑣高昂的制造成本和高毒性，以及許多患者的復(fù)發(fā)及耐藥。

隨之孕育而生的是CAR－NK細(xì)胞免疫療法，作為一種更安全、更快、成本效益更高的方法出現(xiàn)，沒有CAR－T細(xì)胞的嚴(yán)重毒性跡象。由于NK細(xì)胞獨(dú)特的生物學(xué)特性和多種作用機(jī)制，使CAR－NK細(xì)胞治療成為強(qiáng)有力的臨床候選。

大量的CAR－NK臨床前研究已被證明在癌癥治療中有效，尤其是在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療中。到目前為止，有31項臨床試驗探索了11種不同的CAR靶點，包括CD19、CD20、CD22、NKG2D、CD33和BCMA等。在慢性淋巴細(xì)胞白血病（CLL）和難治性和復(fù)發(fā)性淋巴瘤（NCT03056339）中，雙順反子CD19－CD28－ζCAR／IL－15 UCB NK細(xì)胞獲得了令人印象深刻的反應(yīng)（ORR：73％；CR：64％）。

盡管有多種優(yōu)勢，CAR－NK治療仍需面對許多挑戰(zhàn)，這些挑戰(zhàn)可能會引發(fā)耐藥性并影響其療效。因此，我們需要關(guān)注這些機(jī)制，特別是導(dǎo)致血液腫瘤逃避免疫監(jiān)測的CAR－NK功能障礙，從而制定有效策略克服CAR－NK功能衰竭和遷移障礙，保證CAR－NK效應(yīng)的持久性。

制造條件：CAR－NK治療效果的關(guān)鍵因素

過繼細(xì)胞治療的主要問題之一是需要大量具有潛在增殖能力的增強(qiáng)功能效應(yīng)細(xì)胞，以獲得最佳臨床反應(yīng)。因此，優(yōu)化來源、細(xì)胞因子啟動和擴(kuò)增方案可以保證CAR－NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性和體內(nèi)持久性。

細(xì)胞因子啟動和擴(kuò)增

用作開發(fā)CAR－NK治療平臺的最常見來源包括來自PB或UCB的NK細(xì)胞、NK細(xì)胞系（如NK92）和來自IPSC、HESC或CD34＋造血干細(xì)胞的干細(xì)胞衍生NK細(xì)胞。

關(guān)于NK細(xì)胞啟動和擴(kuò)增策略，大多數(shù)基于可溶性細(xì)胞因子和人工抗原呈遞細(xì)胞（aAPC）與膜結(jié)合分子（如細(xì)胞因子和／或共刺激配體）的使用。常見的γ鏈細(xì)胞因子IL－2、IL－7、IL－15和IL－21，以及其他如IL－12或IL－18，單獨(dú)或聯(lián)合使用。如使用經(jīng)基因修飾以表達(dá)膜結(jié)合IL－15或IL－21和4－1BBL的飼養(yǎng)細(xì)胞可大大提高擴(kuò)增倍率，同時保持NK和CAR－NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性潛能。

此外，由于細(xì)胞因子自身的系統(tǒng)給藥可能產(chǎn)生不期望的效果，最新的工程方法側(cè)重于原位遞送和利用細(xì)胞因子信號，以延長NK／CAR－NK細(xì)胞的持續(xù)性，同時保持其優(yōu)化的功能。例如，一種分泌IL－15的CD19 CAR－UCB－NK細(xì)胞，該細(xì)胞在體外顯示出增強(qiáng)的細(xì)胞毒性，并在I／II期臨床試驗中顯示了CAR－NK的持續(xù)性，而患者體內(nèi)沒有系統(tǒng)性IL－15水平升高（NCT03579927）。

自殺傾向降低NK細(xì)胞功效

NK細(xì)胞體外擴(kuò)增可能導(dǎo)致一種“自殺”的不良現(xiàn)象，細(xì)胞識別其它同類細(xì)胞表面的受體或配體，并觸發(fā)針對它們的細(xì)胞毒性活性。在NK或CAR－NK細(xì)胞擴(kuò)增過程中，有幾種機(jī)制可能導(dǎo)致自相殘殺。

其中，眾所周知的Fas／FasL軸是最相關(guān)的機(jī)制之一。FasL介導(dǎo)的細(xì)胞毒性在NK細(xì)胞功能中起關(guān)鍵作用，因為當(dāng)其與靶細(xì)胞中的受體Fas結(jié)合時，它觸發(fā)caspase依賴性凋亡。Fas也可以作為抑制NK細(xì)胞活性的穩(wěn)態(tài)機(jī)制由NK細(xì)胞表達(dá)，稱為活化誘導(dǎo)細(xì)胞死亡（AICD）。據(jù)報道，其表達(dá)在NK細(xì)胞擴(kuò)增過程中可能異常增加，特別是在IL－2、IL－15后或特定飼養(yǎng)細(xì)胞如K562－mIL21存在下培養(yǎng)時，導(dǎo)致自相殘殺。

另一種可能導(dǎo)致NK細(xì)胞間自相殘殺的受體是NKG2D。NKG2D是一種天然受體，主要由NK、CD8＋T和γδT細(xì)胞表達(dá)，識別多種應(yīng)激誘導(dǎo)配體。有越來越多的數(shù)據(jù)描述活化的NK細(xì)胞有NKG2D－L表達(dá)，但其來源和對NK細(xì)胞功能的影響仍有爭議。

在CAR－NK細(xì)胞中，由于CAR配體／抗原識別，也可能出現(xiàn)自相殘殺。例如CD38 CAR－NK細(xì)胞，因為NK細(xì)胞自然表達(dá)CD38，并且在存在IL－2或工程飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下，其表達(dá)可在體外擴(kuò)增期間上調(diào)。因此，NK細(xì)胞可能被抗CD38 CAR識別而破壞。

T細(xì)胞同種異體排斥反應(yīng)

宿主免疫系統(tǒng)對供體NK細(xì)胞的識別和排斥可能潛在地減少同種異體CAR－NK細(xì)胞在臨床環(huán)境中的持續(xù)性。負(fù)責(zé)這些機(jī)制的主要效應(yīng)器是同種異體反應(yīng)性T細(xì)胞，其識別同種異體NK細(xì)胞上的非自身HLA分子。

去淋巴化療誘導(dǎo)宿主免疫系統(tǒng)的短暫降低，從而改善過繼細(xì)胞植入。除了減少T細(xì)胞和NK細(xì)胞外，淋巴細(xì)胞減少藥物還減少了具有免疫抑制特性的細(xì)胞群，如Treg和骨髓源性抑制細(xì)胞（MDSC），為過繼性細(xì)胞擴(kuò)增創(chuàng)造了更有利的微環(huán)境。

目前，正在開發(fā)其他策略以防止宿主系統(tǒng)排斥。如在人類PB－NK細(xì)胞中，通過靶向β－2－微球蛋白基因（β2M）來破壞HLAI類表達(dá)，以規(guī)避CD8＋T細(xì)胞同種異體反應(yīng)性。

克服衰老：增強(qiáng)CAR－NK免疫療效

在缺乏細(xì)胞因子支持的情況下，NK細(xì)胞的體內(nèi)壽命較短，降低了非腫瘤靶向毒性和致瘤風(fēng)險，但也縮小了治療窗口。過繼轉(zhuǎn)移后NK細(xì)胞的體內(nèi)持久性和增殖已顯示與臨床反應(yīng)相關(guān)。因此，由于CAR－NK細(xì)胞的體內(nèi)低持續(xù)性可能導(dǎo)致早期復(fù)發(fā)。此外，短的壽命也限制了NK細(xì)胞在制造過程中的體外增殖和擴(kuò)增，使其難以獲得足夠的細(xì)胞數(shù)量，并縮短了通過基因工程優(yōu)化NK細(xì)胞的時間。因此，延長壽命可以提高CAR－NK細(xì)胞的功效。

與可以持續(xù)數(shù)月乃至數(shù)年的T細(xì)胞不同，人類NK的壽命沒有明確定義，在不同亞群之間存在差異，并且可以在體外進(jìn)行操縱。在體內(nèi)，成熟NK細(xì)胞需要持續(xù)的細(xì)胞因子支持，沒有這種支持，它們在循環(huán)中只能維持1－2周。當(dāng)CAR－NK被工程化以表達(dá)IL－15時最高存活可達(dá)68天。然而，盡管允許通過外源性細(xì)胞因子或HLA匹配來改變壽命，但NK和CAR－NK是受衰老影響的短命細(xì)胞，衰老不可避免地在體外產(chǎn)生，不會在患者體內(nèi)持續(xù)很久。

細(xì)胞衰老與增殖能力的喪失和功能缺陷有關(guān)，其特征是端粒縮短、基因組DNA雙鏈斷裂的檢測、修復(fù)機(jī)制的激活以及細(xì)胞周期的停止。在參與NK細(xì)胞壽命控制的因素中，端粒長度至關(guān)重要。對于過繼性NK細(xì)胞治療，端粒長度取決于NK來源或選擇的活化／擴(kuò)增方法。例如，iPSC衍生的NK細(xì)胞的端粒長度比從PB擴(kuò)增的細(xì)胞長得多。此外，IL－2、IL－15和IL－21都已被證明能上調(diào)NK細(xì)胞中的端粒酶活性，從而防止端粒丟失并允許細(xì)胞延長復(fù)制。通過基因工程異位表達(dá)hTERT可能是提高CAR－NK細(xì)胞持續(xù)性的有效策略，從而提高其治療潛力，其中端粒長度和復(fù)制能力的維持與抗腫瘤效率相關(guān)。

腫瘤微環(huán)境：限制CAR－NK治療效果的絆腳石

NK細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中可被誘導(dǎo)為可逆的耗竭狀態(tài)，其特征是效應(yīng)器功能受損、表型改變以及腫瘤相關(guān)免疫檢查點的表達(dá)上調(diào)。除此之外，患者的NK細(xì)胞和輸注的CAR－NK細(xì)胞在腫瘤生態(tài)位中還會受到免疫抑制細(xì)胞和可溶性細(xì)胞因子產(chǎn)生的不利環(huán)境，從而抑制NK細(xì)胞。

耗竭相關(guān)免疫檢查點

一些研究表明，擴(kuò)增的NK細(xì)胞增加PD－1的表達(dá)，并且NK細(xì)胞產(chǎn)生的IFN－γ在肺癌小鼠模型中增加PD－L1的表達(dá)。目前正在研究將PD－L1 CAR－NK細(xì)胞與pembrolizumab和N－803聯(lián)合用于胃癌和頭頸癌的II期臨床試驗（NCT04847466）。

與NKG2A類似，NK細(xì)胞體外擴(kuò)增可上調(diào)其他耗竭受體的表達(dá)，如TIM－3和TIGIT。在臨床前研究中阻斷TIM－3或TIGIT可提高NK細(xì)胞對實體和血液系統(tǒng)惡性腫瘤的細(xì)胞毒性效力，目前正在多個臨床試驗中測試抑制性抗體（如NCT04623216、NCT03489343、NCT04150965、NCT04354246和NCT05289492）。此外，與T細(xì)胞不同，NK細(xì)胞中其他受體如LAG－3或CTLA－4的表達(dá)水平和抑制相關(guān)性仍不清楚。

總之，并非所有免疫檢查點在體外擴(kuò)增的NK細(xì)胞中以相同的水平誘導(dǎo)，它們在調(diào)節(jié)NK細(xì)胞抗腫瘤活性方面也沒有類似的相關(guān)性。激活和抑制信號的平衡調(diào)節(jié)NK細(xì)胞功能，因此，需要更多的努力來評估存在CAR刺激時每個免疫檢查點表達(dá)的影響，以指導(dǎo)改善CAR－NK治療的策略。

TME中的其它抑制因素

來自TME的可溶性因子可能增強(qiáng)NK細(xì)胞抑制，如通過蛋白水解脫落產(chǎn)生的可溶性NKG2D－L（sNKG2D－1）會降低NKG2D的表達(dá)，減弱NK細(xì)胞的抗腫瘤效力。設(shè)計用于識別相同MICA／B結(jié)構(gòu)域的CAR已在iPSC衍生的NK細(xì)胞中顯示出抗白血病的功效。

此外，大多數(shù)癌癥的TME中存在其它的可溶性因子，如白細(xì)胞介素、酶和代謝物，影響NK細(xì)胞的有效性。其中大部分不僅由腫瘤細(xì)胞釋放，而且由共存于腫瘤生態(tài)位中的免疫抑制細(xì)胞釋放。血液腫瘤中廣泛存在著高濃度的其他抑制性細(xì)胞因子，如IL－6、IL－10和TGF－β。已有研究通過在工程化NK細(xì)胞中敲低TGF－α受體表達(dá)或加入小分子受體激酶抑制劑來增強(qiáng)CAR－NK細(xì)胞治療。

除了可溶性因子，TME中還存在的免疫抑制細(xì)胞通過直接接觸或釋放可溶性因子促進(jìn)腫瘤增殖，同時降低NK細(xì)胞功能。例如Treg、Breg、MDSC和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM），主要是M2表型。缺氧和代謝因素，如營養(yǎng)缺乏和酸度，也會產(chǎn)生不利的微環(huán)境，損害NK細(xì)胞的抗腫瘤活性。

趨化性：影響NK細(xì)胞的遷移和歸巢

CAR－NK免疫治療的挑戰(zhàn)之一在于到達(dá)BM和LNs的有限轉(zhuǎn)運(yùn)和歸巢能力。臨床研究表明，改善過繼輸注NK細(xì)胞進(jìn)入骨髓的情況與更好地控制AML患者的疾病有關(guān)。目前正在臨床前模型中探索維持和／或增強(qiáng)CAR－NK細(xì)胞中趨化因子或粘附受體表達(dá)的多種策略，以改善其遷移和歸巢。

CXCR4、CXCR3、CCR3、CCR5和CX3CR1是NK群體表達(dá)的主要趨化因子受體，它們有助于響應(yīng)TME中存在的趨化因子�？紤]到血液惡性腫瘤TME中發(fā)現(xiàn)的高水平趨化因子，對過繼轉(zhuǎn)移NK細(xì)胞中趨化因子受體的表達(dá)修飾似乎是一種有利的策略。UCB衍生NK細(xì)胞中CXCR4表達(dá)水平高于PB－NK細(xì)胞，表明BM歸巢能力更好。通過雙順反子慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)修飾過表達(dá)CXCR4的CD19－CAR－NK細(xì)胞與huCAR19NK細(xì)胞相比，向CD19＋腫瘤細(xì)胞的遷移增加了兩倍以上。

除了調(diào)節(jié)趨化因子受體表達(dá)的策略外，還可以通過促進(jìn)NK細(xì)胞與E－選擇素等粘附分子的相互作用來增強(qiáng)BM歸巢。例如，用人巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶6（FUT6）和GDP巖藻糖處理NK－92MI細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞表面E－選擇素配體sialyl Lewis X（sLeX），以改善向BM的遷移并增加對B淋巴瘤細(xì)胞的殺傷。

基因編輯：設(shè)計CAR－NK 2．0

基因編輯的應(yīng)用為提高NK細(xì)胞的效率和持久性帶來了巨大希望。為此，不同的研究側(cè)重于識別負(fù)調(diào)節(jié)因子，其可通過增加細(xì)胞毒性、改善代謝和體內(nèi)持久性，或通過克服抑制性免疫檢查點和TME觸發(fā)的功能耗竭機(jī)制，調(diào)節(jié)免疫功能并增強(qiáng)NK和CAR－NK效力。

提高CAR－NK持續(xù)性的主要策略之一是針對抑制性免疫檢查點，如PD－1／PD－L1軸，事實上，NK細(xì)胞中的PD－1敲除增加了卵巢癌異種移植模型中的抗腫瘤活性。TIM－3是NK細(xì)胞表達(dá)的另一個檢查點受體，TIM－3敲除的NK細(xì)胞在體外改善了細(xì)胞毒性。類似的基于CRISPR／Cas9的策略已應(yīng)用于Siglec－7受體，當(dāng)其與腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的某些唾液酸化聚糖結(jié)合時，觸發(fā)NK抑制。

為了避免NK細(xì)胞耗竭，靶向細(xì)胞因子相關(guān)的免疫檢查點是另一種有趣的方法。包括細(xì)胞因子信號抑制劑（SOCS1–7和CIS）在內(nèi)的幾種蛋白質(zhì)通過NK細(xì)胞中的JAK／STAT途徑下調(diào)細(xì)胞因子信號，它們的中斷可增加NK細(xì)胞的活性和持續(xù)性。來自不同的研究表明，NK細(xì)胞中CISH的敲除增加了它們的細(xì)胞毒性特性，甚至改善了它們的代謝適應(yīng)度。

CAR治療的最大挑戰(zhàn)之一，尤其是在實體瘤中，是腫瘤周圍產(chǎn)生的免疫抑制微環(huán)境。幾個研究小組已經(jīng)成功地編輯了NK細(xì)胞，以破壞NK和CAR－NK細(xì)胞中的TGFβ－R2，這使得它們在體外對TGF－β抑制具有抗性，因此增強(qiáng)了對腫瘤的腫瘤控制。

消除CAR－NK細(xì)胞中的CAR靶向受體對于開發(fā)有效的免疫治療產(chǎn)品至關(guān)重要。例如，CD70在NK細(xì)胞中上調(diào)，導(dǎo)致自相殘殺。通過使用CRISPR／Cas9消除NK細(xì)胞中的CD70，獲得了抗自殺傾向的細(xì)胞，而不影響其細(xì)胞毒性效力。按照類似的策略，已經(jīng)證明CD38－CAR－NK細(xì)胞中敲除CD38會導(dǎo)致自相殘殺導(dǎo)致的細(xì)胞死亡減少，并且CAR－NK細(xì)胞對AML原代細(xì)胞的細(xì)胞毒性反應(yīng)更強(qiáng)。

最后，基因編輯可用于調(diào)節(jié)NK細(xì)胞遷移。已經(jīng)表明，使用基因編輯破壞CCR5改變了體內(nèi)NK細(xì)胞遷移，這減少了向肝臟的轉(zhuǎn)運(yùn)并增加了BM歸巢。這種方法有望重新引導(dǎo)CAR－NK細(xì)胞，并提高其抗腫瘤的效力。類似的策略還可用于靶向CAR－NK表面的其他趨化因子受體，并將其重定向至腫瘤部位。

小結(jié)

NK細(xì)胞免疫生物學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)展和進(jìn)步為更好和更新穎的免疫療法奠定了基礎(chǔ)，NK細(xì)胞優(yōu)秀的抗腫瘤作用使其成為細(xì)胞免疫治療的焦點。CAR－NK細(xì)胞療法是一個很有前途的臨床研究領(lǐng)域，與CAR－T細(xì)胞相比，CAR－NK細(xì)胞具有自己獨(dú)特的優(yōu)點，但仍面臨著一些挑戰(zhàn)。這些挑戰(zhàn)包括細(xì)胞的持久性，克服免疫抑制微環(huán)境，以及腫瘤歸巢等。相信解決好這些問題，基于NK細(xì)胞優(yōu)秀的抗腫瘤血統(tǒng)，極有可能在CAR修飾的武裝下為腫瘤治療帶來新的突破。

參考文獻(xiàn)：

1．Overcoming tumor resistance mechanisms inCAR－NK cell therapy． Front Immunol．2022； 13： 953849．

       原文標(biāo)題 : 在CAR-NK細(xì)胞治療中克服腫瘤耐藥機(jī)制