概述 

佐劑，也稱為免疫調(diào)節(jié)劑或免疫增強(qiáng)劑，是疫苗的一種添加劑。佐劑屬于非特異性免疫增強(qiáng)劑，可以增強(qiáng)或改變對抗原的免疫反應(yīng)類型。佐劑不僅可以幫助抗原在體內(nèi)誘導(dǎo)長期有效的特異性免疫反應(yīng)，從而實現(xiàn)更高的疫苗效力，延長免疫反應(yīng)的保護(hù)時間，還可以減少抗原的使用量、生產(chǎn)成本和免疫次數(shù)。

根據(jù)其化學(xué)性質(zhì)，佐劑大致可分為以下幾類：無機(jī)佐劑如含鋁佐劑；乳液型佐劑如MF59和AS03；水溶性佐劑如皂苷；靶向模式識別受體的佐劑如CpG；和細(xì)胞生成佐劑，如白細(xì)胞介素。佐劑與抗原的結(jié)合可以增加抗原的表面積，其生物學(xué)效應(yīng)主要包括：（1）抗原庫效應(yīng)；（2）細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)的上調(diào)，免疫細(xì)胞在注射部位的募集；（3）炎癥小體的激活；以及（4）載體效應(yīng)。一方面，在佐劑作用下，抗原更有可能被抗原遞呈細(xì)胞有效處理和呈遞；另一方面，佐劑可以改變抗原的物理性質(zhì)，從而導(dǎo)致抗原在體內(nèi)的釋放減慢，并延長抗原與免疫細(xì)胞之間的相互作用時間。

目前，已有數(shù)百種天然或合成化合物用于佐劑的研究，但批準(zhǔn)用于疫苗的佐劑數(shù)量仍然有限。氫氧化鋁（AH）和磷酸鋁（AP）仍然主導(dǎo)著人類疫苗制劑的佐劑領(lǐng)域。然而，盡管含鋁佐劑在增強(qiáng)疫苗免疫反應(yīng)方面已經(jīng)應(yīng)用了近幾十年，但含鋁佐劑的作用分子機(jī)制仍未完全了解。因此，有必要加深我們對這些佐劑的物理、化學(xué)和生物特性的理解，為在臨床開發(fā)階段盡早確定每種佐劑的質(zhì)量屬性和選擇合適的佐劑類型提供理論依據(jù)。

鋁佐劑的種類 

目前，獲得許可的人類疫苗中包括的兩種主要類型的鋁佐劑是氫氧化鋁和磷酸鋁。疫苗制劑中AH佐劑與AP佐劑的選擇在很大程度上取決于抗原的性質(zhì)和吸附以實現(xiàn)最佳免疫反應(yīng)的要求。

氫氧化鋁佐劑是通過在精心控制的條件下向鋁離子溶液中加入氫氧化鈉來制備的。溫度、濃度和混合速度是影響所生產(chǎn)佐劑物理化學(xué)性質(zhì)的因素。電子顯微鏡顯示AH佐劑由形成松散微粒聚集體的納米顆粒纖維組成。

磷酸鋁佐劑是通過在磷酸鹽存在下在堿性條件下沉淀鋁離子來制備的。磷酸根離子的加入導(dǎo)致羥基磷酸鋁Al（OH）x（PO4）y的形成，其中一定比例的羥基被磷酸根取代。AP佐劑是無定形的，即非結(jié)晶的，因為磷酸鹽的摻入會干擾結(jié)晶過程。AP佐劑的超微結(jié)構(gòu)顯示初級球形納米顆粒，直徑約50 nm，通常形成松散的微粒聚集體。

無定形羥基磷酸鋁硫酸酯（AAHS）是一種由默克公司生產(chǎn)的含鋁佐劑，用于多種商業(yè)疫苗，包括Recombivax、Gardasil和Vaxelis。AAHS的零電荷點約為7，這意味著它在中性pH下不攜帶表面電荷。在超微結(jié)構(gòu)上，它由類似于AP和明礬沉淀疫苗的片狀納米顆粒組成。因此，AAHS可以被認(rèn)為是一種具有相對低的P∶OH比的不同形式的AP佐劑。

一些獲得許可的疫苗，如Twinrix 和Infanrix Hexa，同時含有AH和AP佐劑。疫苗是通過將選定的抗原與AH或AP佐劑混合，然后通過最佳吸附組分的組合來制備的。電子顯微鏡顯示納米纖維的聚集體與片狀納米顆粒的聚集體相鄰或偶爾與之混合，表明佐劑在混合時保持其主要顆粒結(jié)構(gòu)。

鋁佐劑的理化性質(zhì) 

有許多已建立的測定方法可用于表征鋁佐劑并確保批次之間的一致性。結(jié)構(gòu)信息可以使用X射線衍射（僅適用于AH佐劑）、光譜（傅里葉變換紅外、核磁共振、拉曼）和透射電子顯微鏡獲得。

顆粒度

鋁佐劑通常由初級納米顆粒組成，這些納米顆粒形成尺寸為1至20μm的不規(guī)則形狀的聚集體。顆粒大小和形狀對免疫細(xì)胞通過吞噬作用攝取顆粒的效率具有重要意義。顆粒大小可以使用激光衍射、動態(tài)光散射或微流成像來確定。鋁佐劑的表面電荷取決于pH值，隨著靜電排斥力的降低，當(dāng)pH值接近零電荷點時，觀察到較大的顆粒尺寸。同樣，氯化鈉的加入可以掩蓋表面電荷并增強(qiáng)顆粒聚集。

表面電荷

AH納米顆粒表面的鋁離子與羥基配位，羥基可以接受或提供質(zhì)子，這取決于分散介質(zhì)的pH。因此，AH具有依賴于pH的表面電荷。它的零電荷點（PZC）為11.4，在中性pH下帶正電荷。對于AP而言，由于鋁對磷酸鹽的親和力更高，一部分表面羥基被磷酸鹽取代。商業(yè)AP佐劑的P:Al比為1.1–1.15:1，PZC約為5，這使它們在中性pH下具有負(fù)表面電荷。較大比例的表面羥基導(dǎo)致較高的PZC。

表面積

根據(jù)使用重量FTIR光譜測量的水吸附，組成鋁聚集體的初級納米顆粒為佐劑提供了非常大的表面積，AH佐劑的表面積估計為514 m2/g。表面積也可以在氮吸附后使用Brunauer–Emmett–Teller（BET）理論來確定。雖然這些方法不能用于AP佐劑，但由50nm納米顆粒組成的AP的超微結(jié)構(gòu)表明，AP也具有非常大的表面積。

吸附

鋁佐劑的大表面積允許對抗原具有高吸附能力，這可以用作佐劑表征的關(guān)鍵工具。重要的是，抗原的吸附會影響免疫反應(yīng)的質(zhì)量和程度，并可能增強(qiáng)或降低抗原的穩(wěn)定性。應(yīng)該注意的是，疫苗制劑中抗原的劑量通常較低，并且通常遠(yuǎn)低于完全吸附能力。吸附能力受抗原類型、緩沖液（pH、離子強(qiáng)度、組成）和其他賦形劑的影響，包括穩(wěn)定劑或表面活性劑的存在。吸附的主要機(jī)制是抗原上的磷酸鹽與佐劑上的表面羥基的配體交換，以及靜電和疏水相互作用。

元素組成

鋁佐劑中雜質(zhì)的存在可以使用電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）測定。據(jù)報道，從不同制造商和不同批次獲得的AH佐劑之間金屬離子的類型和數(shù)量存在差異，這可能是由于生產(chǎn)過程中使用的鋁鹽、化學(xué)品和水的來源存在差異。一些污染物，如銅，可能會影響吸附抗原的穩(wěn)定性。

鋁佐劑與抗原結(jié)合的機(jī)制及分析表征

抗原通常可以通過氫鍵、范德華力、疏水作用、靜電吸引和配體交換等方式吸附到含鋁佐劑上，其中靜電吸引最為常見。當(dāng)佐劑和抗原分別具有相反的電荷時，吸附通常取決于靜電吸引。在中性條件下，AP可以吸附帶正電荷的抗原。

配體交換是抗原和佐劑之間最強(qiáng)的吸附，即使佐劑和抗原具有相反的電荷，也可能發(fā)生這種情況。當(dāng)表面活性劑存在于疫苗制劑中時，抗原和佐劑之間的疏水作用增加，抗原和輔料之間的靜電吸附減少。這些作用通常是誘導(dǎo)針對重組亞單位抗原和蛋白毒素的保護(hù)性免疫反應(yīng)所必需的，并且需要根據(jù)抗原的特性篩選合適的佐劑。

對鋁佐劑疫苗的質(zhì)量控制：首先，需要了解鋁吸附抗原的表面電荷性質(zhì)，以預(yù)測疫苗懸浮液的物理性質(zhì)；（2） 其次，測定鋁吸附抗原的吸附速率和吸附強(qiáng)度，可以幫助我們了解鋁佐劑對抗原的吸附能力，以及在不同條件下（如不同pH或離子強(qiáng)度）和長期儲存的吸附能力；（3） 測定鋁吸附抗原的解離動力學(xué)可以幫助我們了解抗原從鋁佐劑中解離的速率以及在不同條件下（如不同溫度或時間）解離的穩(wěn)定性；（4） 最后，需要評估鋁吸附抗原的免疫原性，這通常通過在動物模型中進(jìn)行試驗來測定。

鋁佐劑的免疫刺激機(jī)制

貯庫效應(yīng)

在大多數(shù)情況下，疫苗產(chǎn)品中使用的抗原免疫原性較弱，可以通過與佐劑結(jié)合來增強(qiáng)免疫原性。吸附后，抗原積聚在佐劑顆粒的表面和內(nèi)部，幫助抗原保持其物理和化學(xué)性質(zhì)。大量研究表明，抗原可以與佐劑結(jié)合，在注射部位緩慢釋放，持續(xù)刺激免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫反應(yīng)，這就是貯庫效應(yīng)。

長期以來，疫苗注射部位的貯庫效應(yīng)一直被認(rèn)為是免疫佐劑的主要作用機(jī)制之一。貯庫效應(yīng)受含鋁佐劑的物理性質(zhì)（表面積、電荷和形態(tài)結(jié)構(gòu)）的影響。例如，更大的表面積可以增強(qiáng)抗原吸附，促進(jìn)抗原儲存，并促進(jìn)抗原呈遞到抗原呈遞細(xì)胞（APC）。與含鋁佐劑結(jié)合的抗原不僅有利于呈遞給抗原呈遞細(xì)胞，而且隨著含鋁佐劑的分解，抗原也會緩慢釋放到組織中，導(dǎo)致抗原消耗的延遲，對免疫系統(tǒng)的刺激時間也會延長。此外，抗原和呈遞細(xì)胞之間延長的相互作用間隔也增強(qiáng)了誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。

免疫細(xì)胞的募集

肌肉注射后，鋁佐劑可以刺激身體的先天免疫。先天免疫的主要參與者包括樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、干擾素和補(bǔ)體蛋白。

AH和AP都激活單核細(xì)胞中的免疫系統(tǒng)相關(guān)途徑，與AP相比，體外對AH的免疫反應(yīng)更為明顯。體內(nèi)外實驗證明，AH和AP在注射后可以募集不同種類的細(xì)胞并引發(fā)不同的免疫反應(yīng)。將AH和AP佐劑抗原注射到小鼠肌肉中，注射部位的蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，注射兩種含鋁佐劑后，注射部位附近67%的上調(diào)蛋白重疊，表明這兩種佐劑在刺激免疫反應(yīng)方面有一定的相似性。與AP相比，AH誘導(dǎo)了更多的免疫系統(tǒng)相關(guān)途徑，免疫細(xì)胞在注射部位的募集為適應(yīng)性免疫提供了有利的條件。

APC對抗原吸收的增強(qiáng)

誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的一個關(guān)鍵步驟是APC攝取抗原。鋁佐劑吸附的抗原和細(xì)胞間質(zhì)中游離的抗原都可以被APC吸收，但前者形成的顆粒更容易被APC吸收。抗原和佐劑之間的吸附使抗原在注射部位保持高濃度并緩慢釋放，從而延長APC吸收抗原的時間和抗原對免疫系統(tǒng)的影響。

研究發(fā)現(xiàn)AH在協(xié)助抗原呈遞和處理方面優(yōu)于AP。AP孵育24小時后，抗原呈遞和處理下調(diào)，此時AH孵育還沒有下調(diào)。然而，注射含有AP的抗原可以募集單核/巨噬細(xì)胞，其在孵育48小時后強(qiáng)烈上調(diào)，并且僅AP存在。這表明AH和AP之間存在一些生物學(xué)差異，在疫苗配方中應(yīng)仔細(xì)考慮這些佐劑的選擇。

NLRP3炎癥前信號通路的激活

含鋁佐劑可以募集白細(xì)胞，促進(jìn)樹突狀細(xì)胞分化，并加速局部組織炎癥，不依賴于Toll樣受體。研究表明，含鋁佐劑可以靶向核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域（NOD），如NLRP3。NLRP3是炎癥小體的一個成員，可以識別傳遞到細(xì)胞中的危險信號。巨噬細(xì)胞的主要職責(zé)是吞噬和處理抗原，含鋁佐劑可以通過NLRP3誘導(dǎo)和激活內(nèi)源性免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌高水平的促炎細(xì)胞因子，如IL-1β和IL-18。

AH和AP都可以通過刺激NLRP3炎癥小體來促進(jìn)IL-1β的分泌，但AH可以刺激THP-1細(xì)胞產(chǎn)生比AP更高水平的IL-1β，這可能與這兩種含鋁佐劑在結(jié)構(gòu)、密度、表面電荷和電荷密度方面的差異有關(guān)。

其他免疫刺激機(jī)制

研究發(fā)現(xiàn)，AH可以激活補(bǔ)體，并誘導(dǎo)肉芽形成和巨噬細(xì)胞激活。此外，樹突狀細(xì)胞可以募集鋁吸附的抗原抗體復(fù)合物，補(bǔ)體因子可以調(diào)節(jié)B細(xì)胞上的受體形成鋁吸附的抗原抗體復(fù)合物，從而促進(jìn)免疫反應(yīng)。因此，含鋁佐劑可以激活補(bǔ)體，并通過B細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞進(jìn)一步增強(qiáng)免疫反應(yīng)。

影響鋁佐劑疫苗免疫原性的主要因素

吸附強(qiáng)度

抗原吸附的強(qiáng)度是影響免疫反應(yīng)的主要因素。AP的吸附可以用兩個參數(shù)來評估：單層的最大吸附量，以吸附容量為特征；以及以吸附系數(shù)表征的吸附強(qiáng)度。通常，抗原吸附到鋁佐劑上后，其免疫原性增加，但抗原的穩(wěn)定性隨著吸附時間的增加而降低。此外，吸附在固體顆粒表面的蛋白質(zhì)易于去折疊并失去其二級和三級結(jié)構(gòu)，從而暴露出更多的疏水基團(tuán)，并進(jìn)一步增強(qiáng)其與含鋁佐劑結(jié)合的能力。因此，鋁佐劑的吸附強(qiáng)度對抗原-鋁復(fù)合物的免疫原性、安全性和穩(wěn)定性有重要影響。

P/Al

P/Al是鋁佐劑中磷和鋁元素的摩爾比。研究表明，通過用磷酸鹽預(yù)處理AH以減少羥基的數(shù)量，可以改變配體交換吸附的強(qiáng)度，并且免疫反應(yīng)也可以通過這種方式優(yōu)化。對于帶正電的蛋白質(zhì)，這些化合物的無定形性質(zhì)建立了更大的表面積和更高的吸附能力。

PH和離子強(qiáng)度

溶液的pH和離子強(qiáng)度可以顯著改變佐劑和吸附產(chǎn)物混合物的沉降懸浮液特性，其可以在絮凝狀態(tài)和非絮凝狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換。這些顆粒以松散的聚集體形式存在，當(dāng)它們聚集在一起時具有更高的沉積速率。以這種方式形成的沉積物更松散，通常具有支架狀結(jié)構(gòu)，易于再懸浮。到目前為止，對含鋁佐劑疫苗混合物的懸浮行為與其免疫原性之間的關(guān)系缺乏明確的了解。然而，已經(jīng)證實，沉淀行為嚴(yán)重影響混合物的分散狀態(tài)，從而進(jìn)一步影響疫苗的安全性和穩(wěn)定性。

顆粒度

控制佐劑懸浮液性能的兩個主要因素是顆粒尺寸和分散顆粒的電荷。眾所周知，顆粒尺寸會影響懸浮液中的沉降速率，佐劑的顆粒大小是佐劑性質(zhì)的決定性因素，例如抗原的可用吸附表面積。反過來，這也影響抗原的構(gòu)象，并可能向免疫個體的免疫系統(tǒng)提供功能表位。

抗原類型和應(yīng)用劑量

抗原和AP之間有幾種結(jié)合機(jī)制，其中靜電吸引和配體交換兩種機(jī)制在很大程度上決定了疫苗的吸附和洗脫特性。因此，含鋁佐劑的疫苗效力也取決于疫苗和制劑中抗原的性質(zhì)。在制劑前研究中應(yīng)表征的抗原特性包括：PZC，可接近的磷酸基團(tuán)或產(chǎn)生磷酸基團(tuán)的基團(tuán)的存在，以及溶液的pH對化學(xué)和構(gòu)象穩(wěn)定性的影響。

下一代鋁佐劑

鋁佐劑對疫苗接種在控制傳染病方面的成功做出了重大貢獻(xiàn)。它們在增強(qiáng)對病原體的免疫反應(yīng)方面是有效的，對病原體的保護(hù)依賴于抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。它們價格低廉，安全性良好。然而，在疫苗中使用鋁佐劑有一些局限性。如鋁佐劑無法支持強(qiáng)大的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，這是誘導(dǎo)對某些病原體（如結(jié)核分枝桿菌）的保護(hù)所必需的。因此，下一代鋁佐劑主要致力將Th2的響應(yīng)轉(zhuǎn)換為更多的Th1響應(yīng)。一種方法是以納米鋁為代表，它的顆粒尺寸比傳統(tǒng)的AH更小，同時材料的形狀和結(jié)晶度也發(fā)生了變化。對納米鋁的研究表明，抗體反應(yīng)更強(qiáng)、更持久，APC對抗原的吸收增加，并從Th2反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)門h1/Th17反應(yīng)。另一種方法是將鋁佐劑與其他免疫刺激劑，特別是TLR激動劑相結(jié)合。

人類使用的批準(zhǔn)疫苗中第一種TLR激動劑和鋁佐劑組合是AS04，它包括吸附在鋁上的3-O-去乙�；�-4′-單磷酸脂a（MPL），其使用在兩種GSK開發(fā)的疫苗Cervarix和Fendrix中，分別用于預(yù)防人乳頭瘤病毒和乙型肝炎病毒。MPL是脂多糖（LPS）的解毒版本，是TLR4的激動劑。臨床前研究表明，AS04極大地增強(qiáng)了抗體的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)了高水平的記憶細(xì)胞。Fendrix在人類中證實了這些特征，與單獨使用鋁鹽相比，含AS04佐劑的HBV疫苗表現(xiàn)出更高的血清保護(hù)率和更持久的抗體反應(yīng)。

鋁-TLR激動劑組合佐劑的第二個例子是AS37，它是一種小分子免疫增強(qiáng)劑（SMIP），TLR7的激動劑，吸附在氫氧化鋁上。研究表明，AS37可以在臨床前模型中與許多不同類型的候選疫苗一起使用。在包括靈長類動物在內(nèi)的一系列動物模型中，它可以將免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)換為Th1型，疫苗的免疫原性總體增加。

最后，含鋁組合佐劑包括用胞嘧啶/鳥苷寡脫氧核苷酸（CpG-ODN）加AH，CpG-ODN這是一種已被批準(zhǔn)用于人類的TLR9激動劑免疫增強(qiáng)劑。帶負(fù)電荷的CpG ODNs很容易吸附到AH上。CpG ODNs加AH的聯(lián)合佐劑已經(jīng)應(yīng)用于不同的抗原，包括新冠RBD亞單位和乙型肝炎表面抗原（HbsAg），結(jié)果表明聯(lián)合CpG的鋁佐劑疫苗誘導(dǎo)了更強(qiáng)、更平衡的Th1/Th2細(xì)胞免疫反應(yīng)，并且誘導(dǎo)了更高的抗體反應(yīng)。

小結(jié)

近100年來，鋁佐劑已被用于數(shù)十億劑疫苗，主要用于兒童和青少年。盡管它們有局限性，例如它們相對不能誘導(dǎo)強(qiáng)大的細(xì)胞介導(dǎo)的（Th1）免疫反應(yīng)和對冷凍的易感性，但它們的安全性和耐受性記錄，以及它們的低成本，使這類佐劑繼續(xù)成為疫苗中非常有吸引力的組分。目前，鋁佐劑仍然是評估新的和探索性佐劑的金標(biāo)準(zhǔn)。鋁佐劑疫苗的生物物理特性的最新進(jìn)展，促進(jìn)了新疫苗配方的開發(fā)，并使生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制成為可能。利用鋁佐劑的高吸附能力，它們將越來越多地被用作開發(fā)新型組合佐劑的平臺，能夠驅(qū)動對特定病原體的必要免疫反應(yīng)。這些進(jìn)展將確保在可預(yù)見的未來，鋁佐劑仍然是疫苗配方的支柱。

參考文獻(xiàn)：

1.Aluminum Adjuvants—‘Back to the Future’. Pharmaceutics. 2023 Jul; 15(7): 1884.

2.Research Progress of Aluminum PhosphateAdjuvants and Their Action Mechanisms. Pharmaceutics.2023 Jun17;15(6):1756

       原文標(biāo)題 : 鋁佐劑及其作用機(jī)制的研究進(jìn)展