前言

RAF激酶家族是促腫瘤有絲分裂原活化蛋白激酶途徑的關(guān)鍵激活劑。RAF激酶家族中的絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶（ARAF、BRAF和CRAF）通過絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑向下游傳遞信號，以調(diào)節(jié)參與控制各種細胞機制的基因轉(zhuǎn)錄。RAF蛋白，特別是BRAF和CRAF的過度激活，在許多類型的癌癥中驅(qū)動腫瘤進展和耐藥性。

BRAF突變導(dǎo)致組成型激酶激活，可在多種癌癥中檢測到，最顯著的是甲狀腺癌、黑色素瘤和結(jié)直腸癌。目前，有許多獲批的針對BRAF突變腫瘤的BRAF靶向療法，通常與MEK抑制劑聯(lián)合使用，以最大限度地抑制MAPK通路并延緩耐藥性。此外，KRAS抑制劑的發(fā)現(xiàn)和批準，也在臨床試驗中顯示了極具前景的結(jié)果。

然而，盡管已經(jīng)有了BRAF V600和KRASG12C突變癌癥的治療策略，但仍有許多MAPK活化癌癥患者沒有明確的靶向治療策略。最近，人們越來越關(guān)注癌癥中的RAF1的突變，其編碼CRAF。在MAPK通路改變的腫瘤中，CRAF正在成為對MAPK靶向治療耐藥的關(guān)鍵分子。隨著下一代測序在臨床上的應(yīng)用越來越廣泛，致癌的RAF1改變在患者腫瘤中越來越多地被發(fā)現(xiàn)，專門針對這類致癌突變的藥物正在出現(xiàn)，有望在臨床上得到應(yīng)用。

CRAF的結(jié)構(gòu)和活化

CRAF是一種75kDa的蛋白激酶，在哺乳動物組織中廣泛表達。RAF蛋白家族共有三個保守區(qū)：CR1、CR2和CR3。CR1包含RAS結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RBD）和富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域（CRD），它們結(jié)合RAS。CR2結(jié)構(gòu)域包含14-3-3蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域和一個重要的抑制性磷酸化位點（S259），該位點將CRAF維持在自動抑制狀態(tài)。CR1和CR2位于CRAF的N-末端調(diào)控區(qū)。C末端CR3包含激酶結(jié)構(gòu)域和14-3-3的額外結(jié)合位點（S621）。CR3中含有幾個激活磷酸化位點，并被不同的激酶靶向以激活CRAF。

CRAF激酶活性的調(diào)節(jié)是一個復(fù)雜的過程，涉及幾種蛋白-蛋白相互作用及其細胞定位和磷酸化狀態(tài)的變化。在失活狀態(tài)下，CRAF在細胞質(zhì)中以單體、自動抑制狀態(tài)存在。抑制狀態(tài)由CRAF上的幾個抑制性磷酸化位點維持：S43的磷酸化通過空間位阻阻斷CRAF與RAS的結(jié)合，S233和S259的磷酸化將蛋白復(fù)合物14-3-3募集到CR2，阻止CRAF與質(zhì)膜的結(jié)合。

在有絲分裂信號的下游，當RAS被激活時，它觸發(fā)CRAF向質(zhì)膜的募集，隨后激活。RAS對RBD具有高親和力，但CRAF激活需要RAS與CRD的額外相互作用。此外，CRD與質(zhì)膜中的磷脂相互作用，有助于從抑制狀態(tài)釋放，并穩(wěn)定與RAS的相互作用。在這個過程中，RAS從pS259置換14-3-3，使其可接近蛋白磷酸酶1（PP1）和/或蛋白磷酸酶2A（PP2A），介導(dǎo)其去磷酸化。RAS結(jié)合還誘導(dǎo)CRAF的構(gòu)象變化，釋放N-端和C-端結(jié)構(gòu)域之間的內(nèi)部自抑制相互作用，促進CRAF的“開放”構(gòu)象，并通過多種激酶促進C-端催化結(jié)構(gòu)域中激活位點的磷酸化，包括S338、Y341、T491和S494。此外，CRAF活化還涉及二聚化。目前的證據(jù)表明，野生型RAF蛋白需要RAS和募集到質(zhì)膜進行二聚化，一些致癌BRAF突變體在細胞質(zhì)中以RAS獨立和組成的方式與CRAF異二聚化。

CRAF的致癌作用

RAF1已被表征為人類致癌基因，CRAF蛋白的過度激活是上游信號蛋白（如RAS和生長因子受體）致癌激活腫瘤的常見特征。

CRAF的典型致癌作用是由MAPK通路信號傳導(dǎo)介導(dǎo)的，這通常與其激酶活性和激活周期有關(guān)。許多研究已經(jīng)證明CRAF在多種癌癥背景下調(diào)節(jié)ERK磷酸化的能力。在這些情況下，CRAF最終通過下游激活pERK的許多促腫瘤靶點來促進癌癥的發(fā)生和發(fā)展。除了這種典型途徑外，CRAF還可以以不涉及其激酶活性的MAPK獨立方式促進癌細胞的存活、增殖和遷移。

CRAF的激酶非依賴性作用首次在對Raf1敲除小鼠的研究中得到證實。CRAF在胚胎發(fā)生、血管形成和細胞存活過程中具有重要的激酶非依賴性作用。試驗表明，CRAF在調(diào)節(jié)細胞凋亡中具有與MAPK通路無關(guān)的功能。CRAF可以轉(zhuǎn)移到線粒體，在那里它磷酸化并失活促凋亡蛋白BAD。此外，CRAF可以直接結(jié)合并抑制促凋亡蛋白ASK-1和MST-2。CRAF還可以通過不同的機制調(diào)節(jié)細胞周期的進展。CRAF與腫瘤抑制因子RB相互作用并促進E2F的釋放。CRAF還通過在G2/M轉(zhuǎn)變期間在中心體和有絲分裂紡錘極與極光激酶a和極樣激酶1（PLK1）的相互作用促進小鼠胚胎成纖維細胞和人類結(jié)直腸癌細胞系HCT116中的有絲分裂進展。

RAS原癌基因家族（主要是KRAS、NRAS和HRAS）內(nèi)的激活突變發(fā)生在約30%的所有癌癥患者中，并導(dǎo)致MAPK和PI3K信號通路的組成性激活。盡管BRAF是野生型RAS下游的主要RAF亞型，但多項研究表明，RAS突變癌癥將這種依賴性轉(zhuǎn)變?yōu)镃RAF。此外，體外研究表明，不同的RAS亞型具有不同的激活CRAF的能力。KRASG12V比HRAS G12V106更有效地誘導(dǎo)CRAF向質(zhì)膜的募集和下游MAPK途徑的激活。CRAF結(jié)合親和力和下游ERK磷酸化在不同的RAS突變體中具有廣泛的可變性，這表明RAS突變可以通過MAPK依賴性和MAPK非依賴性的方式誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。

即使在具有野生型RAS的腫瘤中，CRAF也是腫瘤進展所必需的。在缺乏RAS突變的人類腎細胞癌（RCCs）中，在55%的病例中觀察到CRAF的過度磷酸化，表明CRAF在這種癌癥類型中的主要致癌作用。類似地，RAF1過表達還發(fā)生在50%的人肝細胞癌（HCC）中，并與CRAF活性增加有關(guān)。

CRAF的致癌改變

目前，已在癌癥患者中鑒定出腫瘤原性RAF1改變（擴增、融合和突變）。這些改變發(fā)生的頻率低于致癌的BRAF改變，但在患者的腫瘤中越來越多地被發(fā)現(xiàn)。因此，有必要表征RAF1的各種變化，以進一步了解致癌CRAF的生物學效應(yīng)和潛在的治療意義。

RAF1的擴增在膀胱癌中最常見，在黑色素瘤、乳腺癌、胃食管癌、肉瘤、膠質(zhì)母細胞瘤、卵巢癌、肝細胞癌和嗜鉻細胞瘤中也觀察到一定頻率。RAF1融合最常見于毛細胞星形細胞瘤亞群和0.5-1%的前列腺癌、黑色素瘤和胰腺癌。在毛細胞星形細胞瘤中，SRGAP3–RAF1融合最常見；在前列腺癌中，常見ESRP1–RAF1融合。所有的RAF1融合都失去了CRAF的N末端自身抑制結(jié)構(gòu)域，并將致癌C末端結(jié)構(gòu)域與由高表達啟動子調(diào)控的基因偶聯(lián)，導(dǎo)致融合蛋白的過表達。

RAF1的激活突變發(fā)生頻率（~0.7%）遠低于激活BRAF突變（~8%）。這種差異可能歸因于CRAF的基礎(chǔ)激酶活性低于BRAF。最常見的致癌RAF1突變是S257L，其次是密碼子S259和P261的突變。這三個突變體聚集在CR2中，導(dǎo)致關(guān)鍵的自身抑制位點S259的磷酸化顯著降低。此外，CRAF的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)還有多個額外的復(fù)發(fā)致癌突變，包括R391、G361和E478。除了CR2和蛋白激酶結(jié)構(gòu)域的突變外，在人類腫瘤中還發(fā)現(xiàn)了其他RAF1突變，如K106R和L613V。

CRAF在治療反應(yīng)中的作用

新出現(xiàn)的證據(jù)表明，CRAF代表了對許多MAPK靶向療法的治療耐藥性的關(guān)鍵節(jié)點。事實上，BRAF依賴性腫瘤可以轉(zhuǎn)變?yōu)镃RAF依賴性，作為對BRAF靶向治療的抵抗機制。多個致癌RAF1突變（G361A、S257P、P261T和R391W）已被證明對BRAF V600E抑制劑vemurafenib具有耐藥性。

截短的RAF1通過與RAF1融合相同的機制，在體外顯示出在癌癥細胞中賦予對MET靶向治療和EGFR靶向治療的耐藥性。這可能是由于截短的RAF1介導(dǎo)的MAPK通路的過度激活。RAF1融合和突變也與對新型KRAS G12C抑制劑的耐藥性有關(guān)。通過多種機制維持CRAF激活是所有KRAS G12C抑制劑抗性細胞系的共同特征。KRAS G12C抑制劑已被批準用于治療KRAS G12C-突變型肺癌，隨著KRAS抑制劑在臨床開發(fā)中的進展以及BRAF和MEK抑制劑越來越多地用于更廣泛的癌癥類型，CRAF介導(dǎo)的對MAPK抑制劑的耐藥性將在臨床實踐中變得越來越普遍。需要進一步的研究來測試和開發(fā)治療策略，最大限度地減少CRAF介導(dǎo)的MAPK抑制劑耐藥性，并為新發(fā)或獲得性CRAF依賴性腫瘤開發(fā)最佳療法。

CRAF突變腫瘤的潛在治療策略

直接抑制致癌驅(qū)動因素的改變通常是癌基因驅(qū)動腫瘤最有效的靶向治療策略。泛RAF抑制劑是一類新的MAPK抑制劑，可以抑制野生型和突變型BRAF以及野生型CRAF。因此，這些泛RAF抑制劑代表了靶向RAF1改變腫瘤的有前景的新療法。

與BRAF抑制劑（如vemurafenib）不同，泛RAF抑制劑不會在BRAF野生型或RAS突變細胞中引起MAPK途徑的異常激活。此外，與前幾代激酶抑制劑如索拉非尼和瑞戈非尼相比，泛RAF抑制劑是CRAF和BRAF的更特異性抑制劑。目前，許多新型泛RAF抑制劑正處于早期臨床開發(fā)階段，用于治療RAS或BRAF突變腫瘤。

這些泛RAF抑制劑中的大多數(shù)目前也在評估是否與其他靶向療法，如MEK、ERK、EGFR和CDK4/6抑制劑或免疫療法（抗PD1單克隆抗體）聯(lián)合使用。最近報道了泛RAF抑制劑納波拉非尼和MEK抑制劑曲美替尼聯(lián)合應(yīng)用的I期試驗結(jié)果，該試驗在NRAS突變黑色素瘤患者中具有良好的抗腫瘤活性。

小結(jié)

CRAF是一種蛋白激酶，它的突變和過度激活驅(qū)動癌癥的進展和治療耐藥性。臨床實踐中越來越多地發(fā)現(xiàn)癌癥患者中的RAF1改變，但目前，對于RAF1改變的腫瘤，還沒有標準的治療方法。然而，幸運的是，有大量新的臨床前和臨床證據(jù)表明，多種新的靶向治療方法與MAPK通路抑制劑的新組合對RAF1改變的腫瘤具有療效。這些新抑制劑的可用性和有效性突出了CRAF作為癌癥治療靶點的潛力。

參考文獻：

1.  Therole of CRAF in cancer progression: from molecular mechanisms to precisiontherapies. Nat Rev Cancer. 2024 Jan 9.

       原文標題 : CRAF在癌癥進展中的作用：從分子機制到精準治療