2．TIL、淋系和髓系評分相關(guān)的免疫細胞

MCP－counter是一種通過量化RNA測序結(jié)果來評估腫瘤中8個主要免疫細胞和2個基質(zhì)細胞群體豐度的方法。對上述細胞對應(yīng)的10個變量與TIL、淋系和髓系評分的相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)：除中性粒細胞以外，MCP－counter包含的所有免疫相關(guān)變量與TIL評分、淋系評分和髓系評分之間都有很強的相關(guān)性，而成纖維細胞和內(nèi)皮細胞與上述三種評分之間則未發(fā)現(xiàn)相關(guān)（圖2A）。

接下來，進一步評估了TIL評分對淋系和髓系細胞在瘤床中豐度的代表能力。具體方式是運用LASSO模型從MCP－counter的10個變量中選擇最佳的能夠預(yù)測TIL評分的變量。結(jié)果顯示在各種癌癥類型中，平均需要7個（范圍為5－10，圖2B）MCP－counter的變量來預(yù)測TIL，提示TIL能較好地描述腫瘤免疫的情況。為了進一步深入探究，又用上述LASSO模型探究了不同癌癥類型中預(yù)測淋系和髓系評分所使用的MCP－counter中的變量情況（圖2C，D）。

在上述結(jié)果中，可以發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)癌癥類型中，預(yù)測TIL評分最重要的兩個變量是T淋巴細胞和單核細胞，而對于淋系評分的預(yù)測，最重要的變量是T細胞和B細胞，還有重要性稍低的NK細胞和細胞毒性淋巴細胞；對于髓系評分則是單核細胞，這一發(fā)現(xiàn)表明TIL評分可以較好地代表TCGA泛癌隊列中T淋巴細胞和單核細胞豐度，而淋系評分可以代表T細胞、B細胞以及較低程度上代表NK細胞豐度，髓系評分則是單核細胞豐度的良好指標。

圖2A．TIL、淋系和髓系評分與MCP－counter中10個變量的相關(guān)分析；圖2B，C，D．使用LASSO模型基于MCP－counter預(yù)測TIL、淋系和髓系評分時使用的變量情況

3．TIL signature在泛癌TCGA隊列中的預(yù)后評估

接下來，對TIL評分以及淋系和髓系評分在TCGA泛癌隊列中預(yù)測預(yù)后的能力進行評估，將它們與兩個作為黑色素瘤免疫檢查點阻斷療效預(yù)測的signature——IMPRES和IPS進行了比較。IMPRES包括15對免疫檢查點基因，IPS則是效應(yīng)細胞，抑制細胞，主要組織相容性復(fù)合體（MHC）相關(guān)分子，檢查點／免疫調(diào)制劑四個評分的總和。將TIL、淋系和髓系評分視為連續(xù)變量，通過單變量Cox模型評估了這些變量預(yù)測總生存期（OS）和無進展間隔（PFI）的能力（圖3A，B）。以對OS的預(yù)測作為參考基準，TIL、淋系和髓系評分與IPS和IMPRES評分對預(yù)后的預(yù)測能力以及預(yù)測結(jié)果都較為相似，但前三種評分對頭頸部鱗狀細胞癌以及微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)的結(jié)腸癌具有顯著的更好的預(yù)測性能。以對PFI的預(yù)測作為參考基準分析也觀察到了類似的結(jié)果。上述結(jié)果表明TIL，淋系和髓系三種評分可以提供與IMPRES和IPS相同以及互補的預(yù)后信息。

下一步，將TIL，淋系和髓系評分與IMPRES和IPS預(yù)測OS和PFI的時間依賴性ROC曲線的AUC進行了比較，發(fā)現(xiàn)TIL、淋系和髓系評分的AUC非常接近，但在預(yù)測9種癌癥的OS以及10種癌癥的PFI時，它們的表現(xiàn)優(yōu)于IMPRES和IPS（圖3C，D）。為進一步探討TIL對腫瘤預(yù)后預(yù)測的貢獻，首先構(gòu)建包含年齡、性別、腫瘤類型和腫瘤分期的Cox模型，隨后又將基于基因signature的TIL評分和基于HE染色評估的TIL評分添加到模型中。以O(shè)S作為比較基準，發(fā)現(xiàn)基于基因signature的TIL評分在9種癌癥類型中提高了預(yù)后預(yù)測的準確性，而基于HE染色的TIL評分沒有提高模型的精度。在類似的分析中，可發(fā)現(xiàn)淋系評分在6種癌癥類型中提高了預(yù)后預(yù)測的準確性，而基于HE染色的TIL評分依然沒有類似效果。這些數(shù)據(jù)共同說明TIL評分是TCGA泛癌隊列中與OS和PFI相關(guān)的一個強有力的預(yù)后預(yù)測指標，而且提示免疫腫瘤微環(huán)境的整體評估對患者的預(yù)后預(yù)測有重要作用。

圖3A，B．TIL、淋系和髓系評分以及IMPRES和IPS在不同癌癥類型中與患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)；圖3C，D．TIL、淋系和髓系評分以及IMPRES和IPS預(yù)測不同癌癥類型患者預(yù)后的性能對比

4．用于預(yù)測對抗PD－1／PD－L1或CTLA－4反應(yīng)的TIL評分的評價

隨后，對TIL、淋系和髓系評分是否可以作為多個癌癥類型的PD－1／PD－L1抑制劑療效的生物標志物進行探究。為此參考了Yarchoan等人的meta分析——文章中總結(jié)了在幾個已發(fā)表的臨床試驗中單獨使用PD－1／PD－L1抑制劑的客觀緩解率（ORR）。依據(jù)這些數(shù)據(jù)，評估了多個癌癥類型中TIL、淋系和髓系評分的中位數(shù)與PD－1／PD－L1抑制劑使用后ORR之間的相關(guān)性（圖4A－C），觀察到TIL和淋系評分都與PD－1／PD－L1抑制劑使用后ORR有關(guān)，淋系評分的相關(guān)系數(shù)略高于TIL評分；但髓系評分并未觀察到類似的相關(guān)。另外，還對經(jīng)典的生物標志物腫瘤突變負荷（TMB）、擴展免疫signature（EIG）和PD－L1（CD274）表達進行了類似的分析，與預(yù)期一致，所有這些變量都與PD－1／PD－L1抑制劑使用后ORR顯著相關(guān)。評估了TMB、EIG、PD－L1表達和淋系評分四者之間的相關(guān)情況，發(fā)現(xiàn)TMB與EIG，TMB與淋系評分之間都沒有關(guān)系，但EIG、PD－L1和淋系評分三者之間存在密切相關(guān)（圖4D）。

圖4A，B，C．不同癌癥類型的TIL、淋系和髓系評分與應(yīng)用抗PD－1／PD－L1療法后ORR的關(guān)聯(lián)；圖4D．TMB，ORR，CD274表達，淋系評分和EIG的相關(guān)分析

隨后進行了包括TMB、EIG、PD－L1表達和淋系評分這幾個變量的多因素線性回歸，以得到預(yù)測ORR的最佳模型（表1）。使用AIC（一個反映統(tǒng)計模型擬合優(yōu)良性的指標）作為參考，建立了TMB＋淋系評分的最佳模型。用ANOVA對單獨使用TMB和使用TMB＋淋系評分的模型進行比較，發(fā)現(xiàn)淋系評分顯著改善了模型的預(yù)測性能（p＝0．05）。上述結(jié)果提示：單獨使用淋系評分或者淋系評分＋PD－L1表達／TMB的模型有潛力作為簡單而普適的預(yù)測免疫檢查點抑制劑的療效的方法。

表1．包含TMB、EIG、PDL1（CD274）表達和淋系評分的多因素線性回歸結(jié)果