前言

人類自然殺傷細(xì)胞（NK） 占所有循環(huán)淋巴細(xì)胞的15％。NK細(xì)胞發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)70年代，主要與殺死感染的微生物和惡性轉(zhuǎn)化的同種異體和自體細(xì)胞有關(guān)。NK細(xì)胞表現(xiàn)出抗腫瘤細(xì)胞毒性，無需事先致敏和產(chǎn)生細(xì)胞因子以及調(diào)節(jié)各種免疫反應(yīng)的趨化因子。人外周血NK細(xì)胞可分為CD56bright和CD56dim兩大類。CD56brightNK細(xì)胞通常被認(rèn)為是低細(xì)胞毒性的細(xì)胞因子產(chǎn)生細(xì)胞，而CD56dimNK細(xì)胞則具有潛在的細(xì)胞毒性。由于NK細(xì)胞能夠識別和分解腫瘤細(xì)胞，以NK細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療領(lǐng)域已經(jīng)到了一個激動人心的關(guān)頭。

嵌合抗原受體（CAR）是一種受體蛋白，它賦予免疫細(xì)胞新的能力，以靶向特定的抗原蛋白。它的細(xì)胞外抗原結(jié)合域通常為單鏈抗體（scFv），可以識別腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗原。細(xì)胞內(nèi)激活的信號結(jié)構(gòu)域，如CD28、4－1BB（CD137）和OX40，通常起到觸發(fā)免疫細(xì)胞激活和殺傷的作用。表達(dá)CAR的T細(xì)胞能迅速識別腫瘤表面抗原，進(jìn)而裂解腫瘤細(xì)胞。CAR－T細(xì)胞免疫治療在治療急性淋巴細(xì)胞白血�。ˋLL）、慢性淋巴細(xì)胞白血�。–LL）和淋巴瘤等血液腫瘤方面取得了巨大的成就。然而盡管CAR－T細(xì)胞免疫治療技術(shù)發(fā)展迅速，但在臨床應(yīng)用中仍存在一些不足，例如在實體瘤的治療中顯示出很低的療效；此外，大多數(shù)的CAR－T細(xì)胞免疫療法需要自體過繼細(xì)胞移植，因為除非處理HLA屏障，否則異基因T細(xì)胞可能導(dǎo)致移植物抗宿主�。℅VHD）；另外，CAR－T細(xì)胞免疫治療可能會產(chǎn)生一些副作用，對患者的生命造成危害，如細(xì)胞因子釋放綜合征。最新的研究表明，表達(dá)CAR的NK細(xì)胞可能會克服CAR－T細(xì)胞的上述缺陷，并顯示出顯著的抗腫瘤作用。CAR－NK細(xì)胞在腫瘤的免疫治療中展現(xiàn)出廣闊的前景。

CAR－NK細(xì)胞免疫治療的優(yōu)勢

首先，在臨床應(yīng)用中，CAR－NK細(xì)胞免疫療法比CAR－T細(xì)胞免疫療法更安全，而且NK細(xì)胞的安全性已在一些臨床領(lǐng)域得到驗證。例如，一些I／II期試驗顯示，同種異體NK細(xì)胞輸注耐受性良好，不會引起GVHD和明顯的毒性。因此，NK細(xì)胞是一種適應(yīng)性更強(qiáng)的CAR載體，而不僅僅局限于自體細(xì)胞。

CAR－T細(xì)胞免疫治療的主要副作用之一是由于CAR－T細(xì)胞的持續(xù)存在而產(chǎn)生的靶向效應(yīng)。相反，CAR－NK細(xì)胞的壽命很短，幾乎不會產(chǎn)生靶向效應(yīng)。另外，NK細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子種類與T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子種類有很大不同�；钴S的NK細(xì)胞通常產(chǎn)生IFN－γ和粒－巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM－CSF），而CAR－T細(xì)胞通常通過分泌促炎性細(xì)胞因子如TNF－α、IL－1和IL－6誘導(dǎo)細(xì)胞因子風(fēng)暴。

第二，除了通過單鏈抗體識別腫瘤表面抗原來抑制癌細(xì)胞外，NK細(xì)胞還可以通過多種受體識別各種配體來抑制癌細(xì)胞，例如自然細(xì)胞毒性受體（NKp46、NKp44和NKp30）、NKG2D和DNAM－1（CD226）。這些NK細(xì)胞受體通常識別在免疫細(xì)胞或長期治療壓力下腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的應(yīng)激誘導(dǎo)配體。此外，NK細(xì)胞通過FcγRIII（CD16）誘導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性。因此，CAR－NK細(xì)胞可通過CAR依賴和NK細(xì)胞受體依賴性途徑抑制癌細(xì)胞，從而消除腫瘤抗原陽性癌細(xì)胞或表達(dá)NK細(xì)胞受體配體的癌細(xì)胞。臨床試驗表明，CAR－T細(xì)胞不能消除高度異質(zhì)性的癌細(xì)胞，但是CAR－NK細(xì)胞能夠有效地殺死長期治療后可能改變其表型的殘留腫瘤細(xì)胞。

最后，NK細(xì)胞在臨床樣本中非常豐富，可以從外周血（PB）、臍帶血（UCB）、人類胚胎干細(xì)胞（HESC）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（IPSC）甚至NK－92細(xì)胞系中產(chǎn)生。NK－92細(xì)胞提供了一個均勻的細(xì)胞群，并且可以在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下很容易地擴(kuò)大，以進(jìn)行廣泛的臨床應(yīng)用。但是，由于其腫瘤細(xì)胞系來源，必須在輸注前進(jìn)行輻照。相反，活躍的PB－NK細(xì)胞表達(dá)廣泛的受體，無需輻射即可利用，這使得它們能夠在體內(nèi)生成。來源于iPSCs或hESCs的NK細(xì)胞結(jié)合了PB－NK和NK－92細(xì)胞的優(yōu)點，表現(xiàn)出與PB－NK細(xì)胞相似的表型，是一個同質(zhì)的群體。更重要的是，通過采用非病毒轉(zhuǎn)基因方法，CAR可以很容易地在人胚胎干細(xì)胞和／或iPSC來源的NK細(xì)胞中表達(dá)。

CAR－NK細(xì)胞免疫治療的研究現(xiàn)狀

血液瘤

臨床前研究表明，CD19－CAR－NK細(xì)胞對血液系統(tǒng)腫瘤有很高的應(yīng)答率，并且易于制造，與目前的CAR－T細(xì)胞免疫療法相比，這是一個巨大的進(jìn)步。CD19－CAR修飾的NK細(xì)胞具有比CAR－T更明顯的優(yōu)勢，有望顯示出更好的抗腫瘤作用。除了CD19外，淋巴瘤和白血病的CAR－NK細(xì)胞臨床研究也針對CD7（NCT02742727）和CD33（NCT02944162）。目前，有幾種針對血液惡性腫瘤的CAR－NK細(xì)胞臨床試驗正在進(jìn)行中。

實體瘤

CAR治療的一個主要障礙是缺乏對實體瘤的療效。這是由于腫瘤灌注不良、TAA異質(zhì)性和實體瘤伴發(fā)的免疫抑制腫瘤微環(huán)境（TME）所致。

CAR－NK療法試圖解決這些問題，一些臨床試驗已經(jīng)應(yīng)用于實體惡性腫瘤的治療。在實體瘤中進(jìn)展最為廣泛的CAR－NK療法包括檢查點分子程序性細(xì)胞死亡蛋白－1配體（PD－L1）以及常見的腫瘤相關(guān)抗原HER2和MUC1為靶點。

PD－L1在TME和免疫抑制細(xì)胞的幾種癌癥類型中上調(diào)。一種新的NK－92細(xì)胞系被設(shè)計成靶向PD－L1、ER保留的IL－2和高親和力CD16的CAR，稱為PD－L1靶向haNK（t－h(huán)aNK）。令人興奮的臨床前數(shù)據(jù)表明，這些細(xì)胞在體外對15種腫瘤細(xì)胞株具有特異的抗腫瘤作用，在體內(nèi)對三陰性乳腺癌、膀胱腫瘤和肺癌具有很強(qiáng)的抗腫瘤作用。QUITL3．064 I期臨床試驗（NCT04050709）目前正在進(jìn)行，PD－L1 t－h(huán)aNK聯(lián)合其他藥物評估局部晚期或轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者的安全性和有效性也在進(jìn)行中（NCT0439099）。

HER2在幾種癌癥中過度表達(dá)，如乳腺癌、胃癌、食管癌、卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌。HER2也在80％的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)，并且與低生存率相關(guān)。因此，HER2是CAR治療的一個非常有吸引力的靶點。HER2－CAR－T治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤已經(jīng)顯示出這些細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到腫瘤中，但是在TME中高效應(yīng)功能的T細(xì)胞導(dǎo)致抗原丟失變體的快速選擇。ErbB2－NK－92／5．28z CAR－NK將在潛在抗原丟失的情況下保持效應(yīng)器功能，從而使過繼轉(zhuǎn)移細(xì)胞的細(xì)胞毒功能恢復(fù)到基線NK細(xì)胞的細(xì)胞毒功能。這項HER2－CAR－NK治療正在一項3＋3劑量遞增I期臨床試驗（CAR2BRAIN；NCT0338978）中。

MUC1是一種在導(dǎo)管上皮細(xì)胞上表達(dá)的高度糖基化跨膜糖蛋白，其在人類B細(xì)胞和T細(xì)胞上的表達(dá)存在爭議。MUC1在多種癌癥類型中過度表達(dá)，使其成為CAR－T治療的合適靶點。然而，CAR－T療法已被證明是不成功的，因為免疫抑制的TME。為了規(guī)避TME介導(dǎo)的免疫抑制，CAR－NK細(xì)胞被設(shè)計表達(dá)帶有CD28和CD137信號結(jié)構(gòu)域的MUC1－CAR和截短的PD－1肽（MUC1－CAR－NK－92）。這些細(xì)胞在體外和體內(nèi)均能殺傷MUC1靶細(xì)胞。最近完成了一項I期臨床試驗（NCT02839954），評估了Muc1－CAR－NK－92在Muc1陽性復(fù)發(fā)或難治性實體瘤患者中的安全性和有效性。13例PD－L1和MUC1陽性腫瘤患者中，3名退出，9名病情穩(wěn)定，1名患者病情進(jìn)展。主要的觀察指標(biāo)是確定Muc1－CAR－NK－92細(xì)胞的毒性，值得注意的是，試驗中沒有任何患者出現(xiàn)細(xì)胞因子風(fēng)暴或骨髓抑制的跡象。

CAR－NK細(xì)胞面臨的臨床應(yīng)用障礙

體外擴(kuò)增NK細(xì)胞是CAR－NK細(xì)胞免疫治療的第一道障礙。單個供體的NK細(xì)胞數(shù)量不足以進(jìn)行治療，這使得NK細(xì)胞的擴(kuò)張和激活變得非常關(guān)鍵。這一生產(chǎn)過程通常需要兩到三周的時間來培養(yǎng)NK細(xì)胞和某些細(xì)胞因子（IL－2或與IL－15或抗CD3單克隆抗體聯(lián)合使用）。盡管輻照過的K562－mb15－4－1BBL細(xì)胞作為飼料可以改善NK細(xì)胞增殖過程中細(xì)胞的生長，但供體細(xì)胞數(shù)量的可用性仍然是一個障礙。此外，必須完全清除T細(xì)胞，以防止GVHD。因此，如何獲得足夠的NK細(xì)胞仍是一個挑戰(zhàn)。

選擇合適的方法將CAR轉(zhuǎn)化為NK細(xì)胞是CAR－NK細(xì)胞免疫治療的關(guān)鍵。到目前為止，病毒載體和非病毒載體都被用來轉(zhuǎn)化CAR。雖然逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的轉(zhuǎn)染效率很高，但它可能會引起插入突變、致癌和其他不良反應(yīng)。而慢病毒載體盡管顯示出較低的插入突變發(fā)生率，但其對外周血NK細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率低至20％。

mRNA轉(zhuǎn)染CAR－NK細(xì)胞也被認(rèn)為是一種安全、實用的轉(zhuǎn)染方法。研究表明，在異種移植腫瘤模型中，用mRNA方法電穿孔24小時后受體表達(dá)水平超過80％，轉(zhuǎn)染mRNA的NK細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。最近有研究表明，轉(zhuǎn)染mRNA可以有效地避免CAR修飾免疫療法臨床應(yīng)用的一個重要限制因素“靶向非腫瘤”毒性。然而，通過電穿孔方法轉(zhuǎn)染mRNA的CAR－NK細(xì)胞的抗腫瘤作用將是暫時的，因為CARs的表達(dá)水平不會超過3天。

新一代的CAR－NK

一些研究小組正在探索不同的機(jī)制來有效地對抗抗原丟失和免疫抑制TME，從而將提高CAR－NK治療策略的治療壽命和療效，并可能成為下一代CAR－NK治療的支柱。

為了避免抗原逃逸，Mitwasi和他的同事開發(fā)了一種通用型CAR（UniCAR），帶有開關(guān)，以提高安全性和可控性。這項技術(shù)首先在針對E5B9的CAR－T細(xì)胞上得到驗證，E5B9是核抗原La－SS／B的肽表位。由于在細(xì)胞表面沒有發(fā)現(xiàn)這種蛋白，CAR－T必須通過一種稱為靶模塊（TM）的雙特異性分子定向到腫瘤。TMs通常以E5B9肽表位融合到抗TAA的單鏈抗體上。不同的TM可以聯(lián)合應(yīng)用，以同時針對多個TAA，誘導(dǎo)CARs反應(yīng)肽的異質(zhì)性，而不存在靶向效應(yīng)的風(fēng)險。

Mitwasi等人開發(fā)了一個表達(dá)UniCAR的NK－92細(xì)胞系和一個TM，其中E5B9表位連接到IgG4主干上的抗GD2單抗。GD2在多種人類腫瘤中高表達(dá)，是神經(jīng)母細(xì)胞瘤的免疫治療靶點之一。以表達(dá)GD2的神經(jīng)母細(xì)胞瘤和黑色素瘤細(xì)胞為靶點的UniCAR NK－92在體外表現(xiàn)出抗腫瘤細(xì)胞毒性，已準(zhǔn)備進(jìn)一步的臨床開發(fā)。

CAR治療面臨的另一個挑戰(zhàn)是TME。為避免免疫抑制性TME，Wang等構(gòu)建了NK－92細(xì)胞，表達(dá)由細(xì)胞外TGFβRII融合到激活受體NKG2D的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)域組成的修飾CAR（TGFβRII－NKG2D，稱為NK－92－TN）。本質(zhì)上，這種融合將免疫抑制劑TME產(chǎn)生的TGF－β傳遞的信號轉(zhuǎn)換為激活信號。體外培養(yǎng)的NK－92－TN細(xì)胞對TGF－β抑制有抵抗力，無NKG2D下調(diào)，TGF－β共培養(yǎng)后殺傷能力和IFN－γ產(chǎn)生增加。雖然體外實驗數(shù)據(jù)看起來很有希望，但在體內(nèi)，NK－92－TN的抗腫瘤活性并不顯著，終點腫瘤重量的減少很小。在這方面還需要更深入的研究。

展望

自然殺傷細(xì)胞是一組獨特的抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞，具有不受MHC限制的細(xì)胞毒性、產(chǎn)生細(xì)胞因子和免疫記憶等功能，使其成為先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)系統(tǒng)中的關(guān)鍵角色。CAR－NK細(xì)胞療法是一個很有前途的臨床研究領(lǐng)域，對某些癌癥患者具有良好的安全性和初步療效。與CAR－T細(xì)胞相比，CAR－NK細(xì)胞具有自己獨特的優(yōu)點，但仍面臨著一些挑戰(zhàn)。這些挑戰(zhàn)包括細(xì)胞增殖的改善，使細(xì)胞毒性的激活更有效，以及最終找到NK細(xì)胞的最佳重建方法。相信解決好這些問題，基于NK細(xì)胞優(yōu)秀的抗腫瘤血統(tǒng)，極有可能在CAR修飾的武裝下為腫瘤治療帶來新的突破。

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