前言

基因治療是目前最火熱的治療領域之一,因為它針對的是疾病的潛在致病原因而不僅僅是癥狀。目前,我們在基因治療開發(fā)方面取得了巨大進展,在可用的基因治療平臺中,基于腺相關病毒(AAV)的載體顯然已成為最有希望的基因傳遞載體之一。

腺相關病毒在基因治療方面的發(fā)展勢頭越來越大,越來越多的臨床試驗將其用于各種治療。事實上,截至目前監(jiān)管機構只批準了三種體內基因治療方法用于臨床,這三種療法都是基于AAV載體的。2012年,歐洲藥品管理局(EMA)首次批準使用AAV載體治療脂蛋白脂肪酶缺乏癥,但由于需求不足,目前已不再上市。此外,FDA批準的基于AAV的基因療法包括Sparktherapeutics的Luxturna和Avexis的藥物Zolgensma,分別用于治療遺傳性視網膜疾病和脊髓性肌萎縮癥。AAV因其較低的免疫原性和位點特異性整合能力被認為具有更好的安全性。然而,抗AAV的中和抗體在大多數(shù)人群中普遍存在,這限制了AAV的系統(tǒng)應用。

AAV的歷史與病毒學

AAV最早發(fā)現(xiàn)于20世紀60年代,被認為是腺病毒培養(yǎng)的污染物。然而,隨著發(fā)現(xiàn)AAV只有在腺病毒存在下才能復制,以及后來的單純皰疹病毒1型(HSV-1)的存在,腺病毒和AAV之間的聯(lián)系很快建立起來。在確定AAV可以轉化哺乳動物細胞后,研究人員開始生產重組AAV(rAAV)。含有腺病毒DNA的質�？梢元毩⒂谳o助病毒復制AAV。這一發(fā)現(xiàn)推動了該領域的發(fā)展,并真正開啟了AAV的基因治療領域。

AAV是一種小的、無包膜的細小病毒,在20-25nm的衣殼中基因組大小為?4．7kbp。基因組分為復制(REP)和衣殼蛋白質(CAP)的兩個編碼區(qū),基因組兩端都有反向重復序列(ITR)。REP編碼與感染、整合和復制有關的四種蛋白質,Rep40、Rep52、Rep68和Rep78,而CAP編碼三種蛋白,VP1,VP2和VP3,它們分別以1:1:10的比例組成AAV的60-mer衣殼。VP3是最豐富的,構成了外殼結構的外部,而VP1和VP2構成內部。                          

AAV不能獨立復制,只有在輔助病毒(如腺病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒)存在時,才能進行復制和溶細胞性感染,否則只能建立溶源性潛伏感染。AAV將其基因組整合到19號染色體上的一個特定位置,即AAVS1,或在染色體外獨立復制。AAV是非致病性的,即使在其自然狀態(tài)下也不會引起任何疾病;此外,它沒有系統(tǒng)的固有性免疫反應�？偣舶l(fā)現(xiàn)了12種天然的AAV衣殼血清型,并命名為AAV1-AAV12,它們顯示出優(yōu)先與體內特定組織結合的特性。

AAV不僅能感染活躍分裂的細胞,而且能感染靜止的細胞,這使得它對許多病毒和非病毒載體對基因傳遞不敏感的細胞群特別有價值,例如視網膜細胞和神經元細胞。AAV感染靜止細胞的自然能力促進了基因治療的許多顯著進步,例如FDA批準的治療Leber先天性黑朦的Luxturna(Spark Therapeutics)。

臨床上批準的基于AAV的基因治療藥物

在過去的20年中,基于AAV載體的基于治療在臨床轉化中的相關性不斷提高,目前占全球基因治療臨床試驗的8．1%。                      

第一個批準在歐洲臨床使用的基于AAV的基因治療藥物是alipogene tiparvovec(AT),用于治療脂蛋白脂酶缺乏癥(LPLD),這是一種罕見的常染色體隱性疾病。該藥物于2012年獲得批準,商品名為Glybera。AT基因療法提供LPL基因的變體,LPLS447X,以糾正LPL患者LPL的功能。在III期臨床試驗中,給藥AT后14周,低脂飲食后乳糜微粒的峰值水平降低了79%。

目前有17種美國FDA批準的基因療法,包括AAV載體voretigene neparvovec rzyl(VN),由Spark Therapeutics于2017年開發(fā),商品名為Luxturna。VN包含一個包裹RPE6基因的AAV2,用于治療雙等位基因RPE65相關的視網膜營養(yǎng)不良癥,一種罕見的遺傳性疾病,導致視功能受損,隨年齡增長而下降,最終導致失明。在2012年進行的III期臨床試驗中(NCT00999609),Leber先天性黑朦2型患者接受視網膜下注射VN 1年后,65%的參與者獲得最大改善。在VN獲批之前,還沒有治療視網膜營養(yǎng)不良的藥物。

2019年獲得FDA批準的第二種基于AAV的基因療法是Onasemogene abeparvovec xioi(OA),由AveXis開發(fā),商品名為Zolgensma。OA利用表達功能性SMN1轉基因的AAV9治療2歲以下兒童的I型脊髓性肌萎縮癥(SMA1)。SMA1的特點是腦干和脊髓的運動神經元丟失,導致運動功能嚴重受損,并最終因呼吸衰竭死亡。它是導致嬰兒死亡的最常見單基因遺傳性疾病。在2017年一項名為STR1VE的三期臨床試驗中(NCT03306277),接受治療后, 91%的患者在14個月時仍無需永久性呼吸支持,50%的患者在18個月時能夠獨立靜坐。

AAV應用的挑戰(zhàn)

大多數(shù)成功的用于臨床前和臨床研究的AAV僅限于天然的衣殼血清型,但這些AAV血清型在臨床上的廣泛應用存在明顯的局限性。抗AAV的中和抗體的存在仍然是全身輸送的一個重要障礙,這些中和抗體干擾AAV進入靶細胞、細胞內運輸和細胞核內的解包裝,從而阻止了轉導。為了更好地了解接觸AAV所產生的免疫反應,已經進行了一些研究,檢查了產生的IgG亞類,發(fā)現(xiàn)它們主要是IgG1。流行病學研究表明,在30-60%的人群中可發(fā)現(xiàn)血清陽性率不同的中和抗體。這些中和抗體中最流行的是針對AAV2的,其次是AAV1。

AAV介導的基因治療的另一個問題是基因組(4．7kbp)的大小限制,包括ITRs,給轉入的基因只留下一個?4．5kbp的大小空間,這將其靶向適應癥縮小到只能是那些小片段轉基因的表達。

克服中和抗體的解決方案

工程化AAV

AAV可以通過衣殼修飾、表面偶聯(lián)和封裝進行設計,以解決天然AAV的局限性。理論上,克服已有NAB挑戰(zhàn)的最吸引人的方法是將突變引入AAV衣殼,從而阻止NAB的結合。已經證明將點突變引入AAV2衣殼可以減弱這些突變病毒對中和抗體的敏感性。然而,這些位點中的許多對AAV的轉導是必不可少的,因此在不損害其功能的前提下對其進行修飾具有挑戰(zhàn)性。

對于大多數(shù)病毒,也包括AAV,在所有針對病毒的中和抗體中,很大一部分是針對受體結合域的。因此,受體結合域的突變可能是改善中和的最佳方法,但受體結合域的突變也很可能影響病毒的導向性和轉導效率。

此外,使用聚合物、脂類和水凝膠的表面栓系和包封都能夠保護AAV衣殼免受nAbs的侵襲,使其能夠逃避免疫系統(tǒng)的檢測和抗體反應。

血漿置換

“傳統(tǒng)”血漿置換術可以去除所有免疫球蛋白,在從患者血清中去除大多數(shù)NAb方面顯示出一定的前景,盡管只適用于NAb滴度較低的患者。此外,去除所有免疫球蛋白也有其自身的缺點。最近,有研究已經證明,通過將IVIG或人血清與共價偶聯(lián)AAV顆粒的珠子孵育,可以在體外去除中和抗體/因子。在NAb滴度較高的動物中,使用這種珠粒進行血采可以完全恢復肝轉導,而在沒有血采的動物中,肝轉導幾乎不存在。

最近,有研究利用了imlifidase(IdeS),一種鏈球菌胱氨酸蛋白酶,可以將IgG切割成F(ab')2片段和Fc。用IDE處理IVIG可在24小時的潛伏期后完全消化總IgG和抗AAV8IgG。

小結

已有的抗AAV中和抗體對于AAV基因治療來說是一個棘手的問題,因為它們會嚴重限制可能受益于AAV基因治療的患者群體。在過去幾年中,在克服這一巨大障礙方面取得了重大進展,工程化的AAV可以解決這些問題,同時提供了額外的好處。此外,IgG裂解蛋白酶特別適合于使用已有抗AAV抗體的AAV基因治療患者。

隨著全球市場上臨床認可產品的出現(xiàn),以及越來越多正在進行的成功臨床試驗,AAV正處于基因治療的前沿,進一步的技術進步還需要推進更多的臨床試驗來驗證,但AAV已經在未來的基因治療中展現(xiàn)出廣闊的前景。

參考文獻:

1．Anti-AAV Antibodies in AAV Gene Therapy:Current Challenges and Possible Solutions． Front Immunol． 2021; 12: 658399．

2． Synthetically Engineered Adeno-Associated Virus for Efficient,Safe, and Versatile Gene Therapy Applications． ACS Nano． 2020 Oct 19．