前言

2021年5月28日,美國FDA宣布加速批準(zhǔn)安進(jìn)(Amgen)公司開發(fā)的Lumakras(sotorasib,AMG510)上市,用于治療腫瘤攜帶KRAS G12C突變的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者。這些患者至少接受過一種前期全身性治療。這是全球范圍內(nèi)首款靶向KRAS蛋白的抗腫瘤藥物。Lumakras是由安進(jìn)公司開發(fā)的一款“first-in-class”的KRASG12C突變體抑制劑,Lumakras的獲批上市距離安進(jìn)公司提交新藥上市申請(qǐng)(NDA),僅僅6個(gè)月。

AMG510結(jié)構(gòu)RAS基因被發(fā)現(xiàn)是腫瘤中最常見的突變基因之一,30%的腫瘤攜帶RAS變異,如果算上RAS調(diào)控因子和信號(hào)通路上下游的變異,幾乎覆蓋所有腫瘤,RAS變異每年造成一百萬以上的病人死亡,無愧是腫瘤基因之王。這也令人非常好奇,RAS到底具有什么神奇功能,令腫瘤細(xì)胞如此依賴?KRAS的發(fā)現(xiàn)史

RAS是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤基因(oncogene)。KRAS基因的全名叫Kirsten rats arcomaviral oncogene homolog,翻成中文是“Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物”。KARS基因編碼的蛋白是一種小GTP酶(smallGTPase),它屬于RAS超蛋白家族。

19世紀(jì)末,巴斯德等巨匠的研究讓現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在抗感染領(lǐng)域獲得巨大成功。1876年,一個(gè)俄羅斯人成功地將腫瘤組織從一只狗移植到另外一只狗。1908年,兩個(gè)丹麥科學(xué)家發(fā)現(xiàn)母雞白血病細(xì)胞中的提取物可以讓其它鳥類感染白血病。這些觀察和研究讓人們相信腫瘤也是病毒所致的傳染病。1910 年,洛克菲勒研究所的 PeytonRous 從一只來自紐約長(zhǎng)島的母雞中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)腫瘤病毒 Roussarcomavirus(RSV,勞氏肉瘤病毒)。此后,一系列導(dǎo)致動(dòng)物腫瘤的 RNA 和 DNA 病毒相繼被發(fā)現(xiàn)。致病機(jī)理也得到了合理地解釋:這些病毒(RNA病毒通過逆轉(zhuǎn)錄酶)可以將腫瘤基因整合到被感染的宿主細(xì)胞中,誘導(dǎo)惡變并維持腫瘤細(xì)胞的無限分裂。發(fā)現(xiàn)RSV的PeytonRous和發(fā)現(xiàn)RNA病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的HowardTemin分別獲得1966年和1975年的諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。至此,人們深信腫瘤是一種病毒導(dǎo)致的疾病。直到1974年,UCSF 的 J．MichaelBishop 和他的博士后 HaroldVarmus 通過 DNA 探針意外發(fā)現(xiàn)未被感染的正常細(xì)胞中也存在此前 RSV 病毒中發(fā)現(xiàn)的腫瘤基因 src。原來腫瘤基因早就存在于宿主的基因組當(dāng)中,遠(yuǎn)古時(shí)期,病毒從宿主細(xì)胞中獲得這些基因片段并加以改造,也就是說病毒所攜帶的腫瘤基因其實(shí)來自我們自身。這些發(fā)現(xiàn)打開了以基因變異為基礎(chǔ)的現(xiàn)代腫瘤生物學(xué)的大門。Bishop 和 Varmus 也因此在 1989 年獲得了該領(lǐng)域的第三個(gè)諾貝爾獎(jiǎng)。Harvey 和 Kirsten 等人在 60 年代分別發(fā)現(xiàn)了類似于 RSV 的逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的老鼠腫瘤基因 HRAS 和 KRAS。1982 年,Weinberg 等實(shí)驗(yàn)室在人類膀胱癌細(xì)胞T24/EJ中也發(fā)現(xiàn)了HRAS,使得RAS成為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤基因。KRAS基因及其相關(guān)通路

1． KRAS基因的分類

在人的基因組中,有 2 個(gè) KRAS 基因。一個(gè)是 KRAS1,位于第6號(hào)染色體的短臂上;另一個(gè)是 KRAS2,位于第 12 號(hào)染色體的短臂上。其中,KRAS1 是“假基因”,不能被轉(zhuǎn)錄成 RNA,所以它是沒有功能的。而KRAS2才是“真基因”,能夠轉(zhuǎn)錄、并且翻譯成蛋白,具有生物學(xué)活性。通常公司和文獻(xiàn)報(bào)道中所研究的KRAS基因和蛋白,是指“KRAS2”基因及其蛋白產(chǎn)物。

KRAS基因?qū)儆赗AS基因家族。RAS基因家族當(dāng)中,還有NRAS (neuroblastoma-RAS)和HRAS (Harvey-RAS)。

2． KRAS蛋白的結(jié)構(gòu)和位置

KRAS蛋白質(zhì)有188個(gè)氨基酸,它的分子量是21．6KD。擁有GTPase酶活性的鳥嘌呤核苷結(jié)合蛋白。

KRAS蛋白定位在細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè),通過一個(gè)法呢�；�(Farnesyl)的修飾基團(tuán)【1】,連到細(xì)胞膜上。法呢酰基,是通過翻譯后的蛋白修飾,在法呢�；�轉(zhuǎn)移酶【2】的作用下,加到KRAS蛋白上的【3】。

來源:Farnesyltransferaseinhibitorsinhematologicmalignancies:newhorizonsintherapy

3． KRAS相關(guān)通路

來源于網(wǎng)絡(luò)上游信號(hào)通路

正常細(xì)胞中,細(xì)胞膜上的EGFR、HER2、ErbB3和ErbB4等受體單體與細(xì)胞膜外配體結(jié)合形成二聚體,二聚體自身磷酸化,再磷酸化下游的信號(hào)蛋白。其中一條信號(hào)通路可激活Grb2-Shc,再激活SOS蛋白,進(jìn)而可激活KRAS蛋白。

KRAS通路

在細(xì)胞內(nèi),KRAS蛋白在失活和激活狀態(tài)之間轉(zhuǎn)變,當(dāng)KRAS與鳥嘌呤核苷二磷酸(GDP)結(jié)合時(shí),它處于失活狀態(tài),當(dāng)它與鳥嘌呤核苷三磷酸(GTP)結(jié)合時(shí),它處于激活狀態(tài),并且可以激活下游信號(hào)通路。

下游信號(hào)通路

大部分細(xì)胞中的KRAS處于失活狀態(tài),當(dāng)它被激活后,可以激活多條下游信號(hào)通路,其中包括MAPK信號(hào)通路,PI3K信號(hào)通路,和Ral-GEFs信號(hào)通路。這些信號(hào)通路在促進(jìn)細(xì)胞生存、增殖和細(xì)胞因子釋放方面具有重要作用。

4． KRAS活性的調(diào)節(jié)因子

KRAS在失活與激活狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換受到兩類因子的調(diào)節(jié)。

一類是鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF),這類蛋白催化KRAS與GTP的結(jié)合,從而促進(jìn)KRAS的激活,其中包括SOS蛋白(屬GEFs/鳥苷釋放因子/鳥苷酸交換因子)。

另一類是GTP酶(GTPase)激活蛋白(GAPs),這類蛋白能夠促進(jìn)與KRAS結(jié)合的GTP水解成為GDP終止活性狀態(tài),從而抑制KRAS的活性。

KRAS致癌基因的突變

由于 RAS 在許多重要細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的軸上處于中心位置,因此它們與許多癌癥標(biāo)志有關(guān)。RAS是人類癌癥中最常出現(xiàn)突變的致癌基因,目前已經(jīng)在所有人類腫瘤的大約1/5中發(fā)現(xiàn)了突變引起的RAS蛋白激活。

在KRAS的基因突變中,97%是第12號(hào)或者第13號(hào)氨基酸殘基發(fā)生了突變。其中最主要的是G12D、G12V、G13D這三種突變。結(jié)構(gòu)學(xué)研究表明,這些基因突變大多干擾KRAS水解GTP的能力。

KRAS基因的三種主要突變

為什么說KRAS是“不可成藥“靶點(diǎn)?

既然KRAS如此重要,且KRAS基因上的致癌突變十分清楚,那么,為什么到現(xiàn)在為止,仍未上市一個(gè)直接針對(duì)KRAS基因的靶向藥物?原因在于KRAS蛋白是一種無特征、近乎球形的結(jié)構(gòu),無明顯結(jié)合位點(diǎn),很難合成一種能靶向結(jié)合并抑制其活性的化合物。長(zhǎng)期以來無法攻克,KRAS已成為腫瘤藥研發(fā)領(lǐng)域"不可成藥"靶標(biāo)的代名詞。

困難點(diǎn)在于:

1) KRAS的作用泛圍很廣,KRAS的正�；钚砸彩窃S多正常細(xì)胞功能所需要的活性,如選取直接抑制KRAS的藥物,則該藥物毒性可能會(huì)很大,副作用也可能會(huì)很強(qiáng)。且KRAS與NRAS、HRAS有很高的同源性,能抑制KRAS活性的藥物,就很可能會(huì)抑制NRAS、HRAS的活性。那么,這個(gè)藥物的毒性就可能很大。

2) 目前已知的KRAS的活性功能域,主要是KRAS與GDP、或GTP結(jié)合的口袋狀的功能域。與蛋白激酶與ATP的親和力較弱不同, KRAS與GTP、或GDP的結(jié)合非常強(qiáng),親合系數(shù)達(dá)到PicoMolar(皮摩爾濃度,10^-12)級(jí)。而正常細(xì)胞里面的GDP與GTP的濃度,達(dá)到了MicroMolar(微摩爾濃度,10^-6)級(jí)。所以,細(xì)胞內(nèi)正常的GDP與GTP的濃度,比與KRAS結(jié)合所需的濃度,高了10的6次方倍。而RAS缺乏足夠大的能夠結(jié)合小分子的口袋;故要做出一種小分子化合物,其與KRAS的結(jié)合能力,要能與GDP、或者GTP相匹敵,非常難。

3) 設(shè)計(jì)一種只針對(duì)性抑制突變KRAS蛋白的活性藥物,而盡量少影響正常KRAS蛋白的活性,需要此種化合物對(duì)突變的KRAS有很好的選擇性。這是藥物設(shè)計(jì)的又一個(gè)難題。

4) 然而,間接靶向KRAS的策略也是困難重重,包括阻斷KRAS細(xì)胞膜定位和靶向KRAS下游的信號(hào)分子,如RAF、MEK、ERK和PI3K等家族成員。具體而言,間接途徑的困難包括:(1)RAS是正常細(xì)胞生長(zhǎng)和存活相關(guān)的必需途徑,靶向必需途徑首先面臨嚴(yán)重的毒副作用,導(dǎo)致療效指數(shù)非常狹窄甚至沒有;(2)補(bǔ)償逃逸機(jī)制,以及(3)由于嚴(yán)格調(diào)節(jié)導(dǎo)致的信號(hào)反饋和冗余。

靶向KRAS的藥物開發(fā)研究進(jìn)展

近年來,針對(duì)KRAS突變體的共價(jià)抑制劑研究的突破讓通過異構(gòu)位點(diǎn)(allosteric)靶向KRAS突變體成為可能。在KRASG12C突變體中,與突變生成的胱氨酸共價(jià)結(jié)合的小分子更傾向與和GDP結(jié)合的KRAS蛋白相結(jié)合。而這一結(jié)合降低GTP與KRAS的親和力,同時(shí)阻礙GEF催化GTP替換GDP,將KRASG12C突變體鎖死在失活狀態(tài)。KRASG12C突變體上這一結(jié)合“口袋“的發(fā)現(xiàn)催生了多款靶向KRASG12C突變體的小分子共價(jià)抑制劑。以下是國內(nèi)外KRAS靶點(diǎn)藥物的在研企業(yè):

全球在研KRAS抑制劑(藥智網(wǎng)早前數(shù)據(jù),不完全統(tǒng)計(jì))

中國在研KRAS抑制劑(藥智網(wǎng)早前數(shù)據(jù),不完全統(tǒng)計(jì))