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前言

人類自然殺傷細胞（NK） 占所有循環(huán)淋巴細胞的15％。NK細胞發(fā)現(xiàn)于20世紀70年代，主要與殺死感染的微生物和惡性轉(zhuǎn)化的同種異體和自體細胞有關。NK細胞表現(xiàn)出抗腫瘤細胞毒性，無需事先致敏和產(chǎn)生細胞因子以及調(diào)節(jié)各種免疫反應的趨化因子。人外周血NK細胞可分為CD56bright和CD56dim兩大類。CD56brightNK細胞通常被認為是低細胞毒性的細胞因子產(chǎn)生細胞，而CD56dimNK細胞則具有潛在的細胞毒性。由于NK細胞能夠識別和分解腫瘤細胞，以NK細胞為基礎的腫瘤免疫治療領域已經(jīng)到了一個激動人心的關頭。

嵌合抗原受體（CAR）是一種受體蛋白，它賦予免疫細胞新的能力，以靶向特定的抗原蛋白。它的細胞外抗原結(jié)合域通常為單鏈抗體（scFv），可以識別腫瘤細胞表面的特異性抗原。細胞內(nèi)激活的信號結(jié)構(gòu)域，如CD28、4－1BB（CD137）和OX40，通常起到觸發(fā)免疫細胞激活和殺傷的作用。表達CAR的T細胞能迅速識別腫瘤表面抗原，進而裂解腫瘤細胞。CAR－T細胞免疫治療在治療急性淋巴細胞白血�。ˋLL）、慢性淋巴細胞白血�。–LL）和淋巴瘤等血液腫瘤方面取得了巨大的成就。然而盡管CAR－T細胞免疫治療技術發(fā)展迅速，但在臨床應用中仍存在一些不足，例如在實體瘤的治療中顯示出很低的療效；此外，大多數(shù)的CAR－T細胞免疫療法需要自體過繼細胞移植，因為除非處理HLA屏障，否則異基因T細胞可能導致移植物抗宿主�。℅VHD）；另外，CAR－T細胞免疫治療可能會產(chǎn)生一些副作用，對患者的生命造成危害，如細胞因子釋放綜合征。最新的研究表明，表達CAR的NK細胞可能會克服CAR－T細胞的上述缺陷，并顯示出顯著的抗腫瘤作用。CAR－NK細胞在腫瘤的免疫治療中展現(xiàn)出廣闊的前景。

CAR－NK的研究概況

CAR－NK臨床前研究的數(shù)量逐年增加，這體現(xiàn)在每年都在增加的關于CAR－NK的研究論文。

此外，在研究的靶標方面，Her2是實體瘤最常用的靶點，而CD19抗原在血液腫瘤中最常見。使用原代NK細胞的研究中，65％的人在研究B細胞惡性腫瘤，CD19是最受歡迎的靶點。有趣的是，在使用NK細胞系的研究中，研究實體瘤是血液惡性腫瘤的2倍以上。

CAR結(jié)構(gòu)的設計

NK細胞上表達的功能性CAR分子由三部分組成：胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)以及胞內(nèi)的信號結(jié)構(gòu)域。胞外結(jié)構(gòu)域由一個信號肽和識別抗原的單鏈抗體片段（scFv）組成，一段鉸鏈區(qū)將這個結(jié)構(gòu)連接到跨膜區(qū)，它也在細胞內(nèi)連接到包含激活信號的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。成功的CAR設計是通過仔細的設計和功能測試相結(jié)合來實現(xiàn)的。

載體骨架和啟動子

載體骨架包含表達CAR所需的所有元件，如啟動子、polyA信號和轉(zhuǎn)錄調(diào)控片段。

啟動子的選擇直接影響到轉(zhuǎn)基因的表達水平。目前，對不同啟動子在NK細胞系中的CAR表達和功能的比較只有一次報道，而對原代NK細胞沒有比較數(shù)據(jù)。就這一次單個報告來看，還不能確定CAR－NK細胞的最佳啟動子。

目前關于CAR－NK細胞的報道顯示，多種啟動子被用于驅(qū)動CAR的表達，無論是細胞系來源的還是原代NK細胞。在原代CAR－NK和CAR－NK細胞系中，病毒啟動子（CMV、MPSV、MMLV、SFFV等）比組成性活性啟動子（如EF1α、CMV和PGK）更常用。

信號肽

在信號肽中存在著巨大的異質(zhì)性，這直接轉(zhuǎn)化為不同水平的蛋白質(zhì)分泌效率。對于CAR－NK和CAR－T細胞，還沒有確定最佳信號肽的比較研究。目前，CD8a－SP是原代NK細胞最常用的信號肽序列（16％，71％的研究中未公布）和NK細胞系的免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽（29％）。

單鏈抗體

單鏈抗體片段是CAR的腫瘤抗原結(jié)合域，該結(jié)構(gòu)域?qū)�決定CAR－NK細胞的特異性和功能。

由于單鏈抗體不是抗體的天然形式，因此重鏈和輕鏈的順序是人工確定的。到目前為止，對于CAR－NK設計，大多數(shù)更喜歡VH－VL方向，而不是VL－VH方向。Fujiwara等人證明重鏈和輕鏈的順序不影響T細胞上抗KDR CAR的表達水平。

此外，細胞可以配備多個單鏈抗體，從而擴大CAR效應細胞的抗原識別能力。在這里，有多種選擇：CARs可以用雙元件的載體轉(zhuǎn)導，誘導兩個CAR結(jié)構(gòu)的表達；或者將兩個單鏈抗體融合在一個結(jié)構(gòu)中，產(chǎn)生串聯(lián)單鏈抗體的“單柄”CAR。雖然這些技術已用于生產(chǎn)CAR－T細胞，但CAR－NK細胞仍未知。

目前大多數(shù)臨床CAR－T細胞試驗都使用了來自小鼠抗體的單鏈抗體，這增加了抗小鼠IgG細胞宿主抗移植物病的風險，這個問題可以通過人源化或篩選全人抗體避免。然而不幸的是，由于這些CAR受體的嵌合特性，即使是人源化的單鏈抗體也可能誘導宿主抗獨特型免疫反應。幸運的是，在迄今為止數(shù)量有限的CAR－NK臨床試驗中，沒有發(fā)現(xiàn)與抗CAR免疫反應相關的重大副作用。

連接區(qū)

重鏈和輕鏈之間的連接區(qū)有助于穩(wěn)定單鏈抗體的構(gòu)象，過短會導致多聚體的形成，過長可能導致水解或降低VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的關聯(lián)。對于CAR－NK細胞，五肽GGGGS的多聚體應用最為廣泛，通常為3個重復。另一個旨在增強蛋白水解穩(wěn)定性的連接體是Whitlow“218”連接體：GSTGSGSKPGSGEGSTKG。

目前，雖然大多數(shù)CAR－NK研究沒有提供連接細節(jié)，但已有的研究報道中，有22項使用了G4S連接，有2項應用了218連接。

鉸鏈區(qū)

鉸鏈區(qū)是連接單鏈抗體單位和跨膜結(jié)構(gòu)域的CAR細胞外結(jié)構(gòu)區(qū)，它通常維持效應細胞中穩(wěn)健的CAR表達和活性所需的穩(wěn)定性。大多數(shù)CAR－NK構(gòu)建使用CD8α或CD28胞外結(jié)構(gòu)域的衍生物或基于IgG的鉸鏈區(qū)。

鉸鏈區(qū)的類型和長度對CAR的功能活動有重要影響。但是目前大多數(shù)信息全來自CAR－T領域，能否直接轉(zhuǎn)化為CAR－NK還有待證明。

在CD28和CD8α鉸鏈區(qū)之間的直接比較中，發(fā)現(xiàn)CD28更有可能促進CAR分子的二聚化，因此，CD28鉸鏈區(qū)的CAR產(chǎn)生的激活刺激更強。雖然這可能是有益的，但也可能導致更嚴重的副作用。

IgG為基礎的鉸鏈區(qū)也廣泛應用于CAR結(jié)構(gòu)。基于IgG鉸鏈區(qū)的一個主要優(yōu)點是結(jié)構(gòu)的靈活性，該結(jié)構(gòu)通常由IgG1或IgG4的FC部分或Fc部分的CH2／CH3結(jié)構(gòu)域組成。鉸鏈區(qū)的長度可以調(diào)節(jié)以適應抗原識別，但研究發(fā)現(xiàn)，間隔區(qū)越短，細胞因子的產(chǎn)生越高，CAR－T細胞增殖越快，體內(nèi)持久性和抗腫瘤效果越好。

對于CAR－NK細胞，大多數(shù)研究在原代NK細胞（16／35）和CAR－NK細胞系（41／72）中均采用CD8α鉸鏈區(qū)。其它使用的鉸鏈區(qū)包括CD28、IgG Fc結(jié)構(gòu)域和DAP12。

跨膜結(jié)構(gòu)域

跨膜（TM）結(jié)構(gòu)域連接CAR的胞外結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)激活信號結(jié)構(gòu)域，CAR－NK最常用的TM部分來自CD3ζ、CD8和CD28，但其他如NKG2D、2B4、DNAM1也有被使用。

TM結(jié)構(gòu)域的選擇影響了CAR結(jié)構(gòu)在細胞功能上的活化程度。通常在NK細胞上表達的分子如DNAM－1、2B4和NKG2D的TM會導致更多的CD107a脫顆粒和更高的細胞毒性，因此，TM的具體來源將決定CAR－NK的活性。

TM結(jié)構(gòu)域的一個重要方面是，最佳TM區(qū)域應遵循T細胞或NK細胞上跨膜蛋白的蛋白質(zhì)自然取向（N端到C端順序）。NKG2D雖然是一種強大的NK細胞激活劑，然而，天然NKG2D具有C端到N端的跨膜區(qū)。

目前，CD8α和CD28修飾的TM在原代CAR－NK細胞中最常見，而CD28是CAR－NK細胞系的首選TM區(qū)域。

CAR－NK激活信號

CAR的細胞內(nèi)激活信號的數(shù)量決定了其屬于哪一“代”CAR。

第一代CAR－NK細胞與CAR－T細胞一樣，只含有CD3ζ信號。第二代和第三代CAR－NK分別攜帶一個和兩個額外的共刺激信號，共刺激分子通常來源于CD28家族（CD28和ICOS）、TNFR家族（4－1BB、OX40和CD27）或SLAM相關受體家族（2B4）。到目前為止，唯一公布的CAR－NK臨床試驗采用了第二代CAR－NK構(gòu)建，該構(gòu)建通過加入IL－15表達和誘導Caspase9增強活性。

目前大多數(shù)CAR結(jié)構(gòu)依賴于CD3ζ鏈信號域，強烈的激活信號對于誘導有效的抗腫瘤反應很重要，但也可能導致效應細胞的快速衰竭。因此，共刺激域的組合可用于校準所需的免疫細胞反應。與基于4－1BB的 CARs相比，基于CD28的CARs表現(xiàn)出更快的效應器特征，誘導更高水平的IFN－γ、顆粒酶B、TNF－α。然而，這種強烈的共刺激信號也會導致活化誘導的細胞死亡（AICD）。

相比較，4－1BB－CD3ζ信號優(yōu)先誘導記憶相關基因和持續(xù)的抗腫瘤活性。原因可能是4－1BB結(jié)構(gòu)域改善了CD28結(jié)構(gòu)域引起的T細胞耗竭。

如上圖所示，在CAR－NK細胞系和原代CAR－NK細胞的研究中，CD3ζ幾乎被普遍用作主要的激活域，其中大約一半攜帶一個額外的激活域，通常添加4－1BB或CD28。至于第三代結(jié)構(gòu)，CD28／4－1BB／CD3ζ的組合是最常用的。

CAR的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導載體

隨著基因修飾技術的進步，許多方法被用于產(chǎn)生CAR－NK。兩種主要方法是病毒轉(zhuǎn)導（使用慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒），或轉(zhuǎn)染裸質(zhì)粒DNA、轉(zhuǎn)座酶DNA介導的整合以及mRNA電轉(zhuǎn)。

慢病毒

慢病毒能夠高效地轉(zhuǎn)導周期性和非周期性細胞，在基因治療領域得到了廣泛的應用。迄今為止，已有14篇關于原代CAR－NK細胞和44篇關于CAR－NK細胞系的研究成功使用慢病毒作為載體。

在臨床前研究中，21項研究使用了第二代病毒，6項研究使用了第三代慢病毒來產(chǎn)生表達CAR的NK細胞系（17個未知）。在原代CAR－NK細胞研究中，5項研究使用了第三代慢病毒，7項研究使用了第二代慢病毒載體（2個未知）。

逆轉(zhuǎn)錄病毒

幾十年來，逆轉(zhuǎn)錄病毒一直被用作基因治療載體。迄今為止，有20項使用CAR－NK細胞系的研究和15使用原代NK細胞的研究應用了逆轉(zhuǎn)錄病毒。最近的一項I期臨床試驗中，由逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導的CD19 CAR－NK細胞治療CD19＋非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴細胞白血病。在這項研究中，73％的患者有響應，8名患者中有7名獲得完全緩解。此外，在所有劑量水平下，CAR－NK輸注后30天內(nèi)反應迅速。經(jīng)過一年的隨訪，仍然可以檢測到擴增的CAR－NK細胞。輸注后，外周血中的CAR－NK DNA拷貝數(shù)保持穩(wěn)定達一年之久，這些結(jié)果首次表明逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導的CAR－NK細胞可以在體內(nèi)長期存活。

不同種類的逆轉(zhuǎn)錄病毒被用來產(chǎn)生CAR－NK細胞。與γ逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒相比，RD114α逆轉(zhuǎn)錄病毒在原代NK細胞的轉(zhuǎn)導效率上更高。盡管使用不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒可以在NK細胞中獲得長時間穩(wěn)定的CAR表達，但逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)的安全性仍然是一個值得關注的問題，尤其是與更安全的慢病毒相比。

mRNA電穿孔

電穿孔CAR編碼mRNA是一種快速、有效但是作用短暫的一種方法。迄今為止，有9個關于CAR－NK細胞系和11個原代CAR－NK細胞研究使用了mRNA電穿孔。

一般來說，擴增或活化的NK細胞的mRNA轉(zhuǎn)染效率遠高于新鮮分離的NK細胞。由于mRNA的合成符合GMP的規(guī)定，并且電穿孔可以在潔凈室中進行，因此通過mRNA電穿孔產(chǎn)生符合GMP的CAR－NK是可行的。然而，這種方法的主要缺點是CAR表達的窗口短暫：電穿孔后，CAR－NK細胞應在7天內(nèi)輸回患者體內(nèi)。

睡美人轉(zhuǎn)座子

基于轉(zhuǎn)座子的系統(tǒng)可以在預定的位置高效地導入CAR轉(zhuǎn)基因，這是傳統(tǒng)方法所不具備的一個重要優(yōu)勢。轉(zhuǎn)座子主要通過電穿孔導入NK細胞，然后通過轉(zhuǎn)座子酶整合到宿主基因組中。有兩項研究應用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)來產(chǎn)生CAR－NK細胞：一項使用NK－92－MI細胞，另一項研究將轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染到iPSC細胞，然后分化成NK細胞。富集后，抗間皮素CARs在iPSC衍生的NK細胞上穩(wěn)定表達，并在卵巢癌小鼠模型中發(fā)揮出作用。

CRISPR／Cas9

CRISPR／Cas9是一種強大的基因改造技術，這項技術依賴于將Cas9蛋白與引導RNA一起導入NK細胞。最初，這種技術被用于原代NK細胞，以破壞CD38基因，旨在防止NK細胞與daratumumab （抗CD38）聯(lián)合使用時的自相殘殺，因為CD38在NK細胞、多發(fā)性骨髓瘤和AML細胞上均有表達。

最近，CRISPR／Cas9被用于引入新基因。在一些采用HDR模板的研究中，使用K562－mIL－21擴增的NK細胞獲得了超過75％的敲入效率。然而，在新鮮NK細胞中，敲入效率僅為3–16％�？偟膩碚f，CRISPR／Cas9策略是一種很有前景的技術，它可以用來精確地刪除、修復或?qū)�入特定基因，有望產(chǎn)生強大的抗腫瘤NK細胞。

CAR－NK細胞免疫治療的優(yōu)勢

首先，在臨床應用中，CAR－NK細胞免疫療法比CAR－T細胞免疫療法更安全，而且NK細胞的安全性已在一些臨床領域得到驗證。例如，一些I／II期試驗顯示，同種異體NK細胞輸注耐受性良好，不會引起GVHD和明顯的毒性。因此，NK細胞是一種適應性更強的CAR載體，而不僅僅局限于自體細胞。

CAR－T細胞免疫治療的主要副作用之一是由于CAR－T細胞的持續(xù)存在而產(chǎn)生的靶向效應。相反，CAR－NK細胞的壽命很短，幾乎不會產(chǎn)生靶向效應。另外，NK細胞產(chǎn)生的細胞因子種類與T淋巴細胞產(chǎn)生的細胞因子種類有很大不同�；钴S的NK細胞通常產(chǎn)生IFN－γ和粒－巨噬細胞集落刺激因子（GM－CSF），而CAR－T細胞通常通過分泌促炎性細胞因子如TNF－α、IL－1和IL－6誘導細胞因子風暴。

第二，除了通過單鏈抗體識別腫瘤表面抗原來抑制癌細胞外，NK細胞還可以通過多種受體識別各種配體來抑制癌細胞，例如自然細胞毒性受體（NKp46、NKp44和NKp30）、NKG2D和DNAM－1（CD226）。這些NK細胞受體通常識別在免疫細胞或長期治療壓力下腫瘤細胞上表達的應激誘導配體。此外，NK細胞通過FcγRIII（CD16）誘導抗體依賴性細胞毒性。因此，CAR－NK細胞可通過CAR依賴和NK細胞受體依賴性途徑抑制癌細胞，從而消除腫瘤抗原陽性癌細胞或表達NK細胞受體配體的癌細胞。臨床試驗表明，CAR－T細胞不能消除高度異質(zhì)性的癌細胞，但是CAR－NK細胞能夠有效地殺死長期治療后可能改變其表型的殘留腫瘤細胞。

最后，NK細胞在臨床樣本中非常豐富，可以從外周血（PB）、臍帶血（UCB）、人類胚胎干細胞（HESC）、誘導多能干細胞（IPSC）甚至NK－92細胞系中產(chǎn)生。NK－92細胞提供了一個均勻的細胞群，并且可以在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下很容易地擴大，以進行廣泛的臨床應用。但是，由于其腫瘤細胞系來源，必須在輸注前進行輻照。相反，活躍的PB－NK細胞表達廣泛的受體，無需輻射即可利用，這使得它們能夠在體內(nèi)生成。來源于iPSCs或hESCs的NK細胞結(jié)合了PB－NK和NK－92細胞的優(yōu)點，表現(xiàn)出與PB－NK細胞相似的表型，是一個同質(zhì)的群體。更重要的是，通過采用非病毒轉(zhuǎn)基因方法，CAR可以很容易地在人胚胎干細胞和／或iPSC來源的NK細胞中表達。

小結(jié)

自然殺傷細胞是一組獨特的抗腫瘤效應細胞，具有不受MHC限制的細胞毒性、產(chǎn)生細胞因子和免疫記憶等功能，使其成為先天性和適應性免疫反應系統(tǒng)中的關鍵角色。CAR－NK細胞療法是一個很有前途的臨床研究領域，對某些癌癥患者具有良好的安全性和初步療效。與CAR－T細胞相比，CAR－NK細胞具有自己獨特的優(yōu)點，但仍面臨著一些挑戰(zhàn)。這些挑戰(zhàn)包括細胞增殖的改善，使細胞毒性的激活更有效，以及最終找到NK細胞的最佳重建方法。相信解決好這些問題，基于NK細胞優(yōu)秀的抗腫瘤血統(tǒng)，極有可能在CAR修飾的武裝下為腫瘤治療帶來新的突破。

參考文獻：

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2． Natural Born Killers： NK Cells in Cancer Therapy． Cancers （Basel）． 2020 Jul 31；12（8）：2131

3．Exploring the NK cell platform for cancer immunotherapy． Nat RevClin Oncol． 2020 Sep 15．

4． Chimeric antigen receptornatural killer （CAR－NK） cell design and engineering for cancer therapy． JHematol Oncol． 2021； 14： 73．

       原文標題 : CAR-NK結(jié)構(gòu)的設計與載體